# Hmotnostní spektrometrie a potvrzení identity peptidu > Jak hmotnostní spektrometrie potvrzuje identitu peptidu: ESI vs MALDI, naměřená vs teoretická hmotnost, nábojové stavy a posuny hmotnosti, které musí znát každý čtenář COA. Webová stránka: https://peptidemedixeu.com/cs/learn/mass-spectrometry-peptide-identity/ · Peptide Medix EU · 3 min čtení · Aktualizováno: 2026-11-26 [Hmotnostní spektrometrie](https://peptidemedixeu.com/cs/glossary/mass-spectrometry/) potvrzuje identitu peptidu tím, že molekulu „zváží“: přístroj měří poměr hmotnosti k náboji ionizovaného peptidu, software z něj zrekonstruuje molekulovou hmotnost a tato naměřená hmotnost se porovná s hmotností vypočtenou z plánované sekvence. Shoda v rámci tolerance metody – u kontroly kvality ve výzkumném měřítku obvykle zlomek daltonu – je důkazem, že lahvička obsahuje molekulu uvedenou na etiketě. HPLC to poskytnout nedokáže: [chromatogram](https://peptidemedixeu.com/cs/blog/read-peptide-coa-like-chemist/) říká, jak homogenní materiál je, nikdy však, čím je. Na certifikátu analýzy proto hmotnostní spektrometrie a HPLC odpovídají na doplňující se otázky – identitu a čistotu – a tento průvodce se věnuje té první. ## Jak se peptid „váží“ Hmotnostní spektrometr potřebuje peptid ve formě iontů v plynné fázi. V kontrole kvality peptidů převládají dvě ionizační metody: - ESI (ionizace elektrosprejem). Rozpuštěný peptid se rozprašuje nabitou kapilárou, čímž vznikají ionty nesoucí jeden, dva, tři či více protonů. ESI lze přímo spojit s HPLC (LC-MS), a proto je běžnou volbou při uvolňovacím testování. - MALDI-TOF. Peptid se spolukrystalizuje s matricí absorbující UV záření a desorbuje laserovými pulzy, převážně jako jednou nabité ionty, přičemž hmotnost se měří metodou doby letu. Metoda je rychlá a snáší soli, a proto je běžná při kontrolách v syntetických laboratořích. V obou případech je výstupem spektrum píků poměru hmotnosti k náboji (m/z), z nichž se vypočte neutrální molekulová hmotnost. ## Čtení spektra ESI: nábojové stavy Spektrum ESI jednoho čistého peptidu obvykle vykazuje několik píků, což začínající čtenáře mate a vede je k tomu, že v nich vidí „nečistoty“. Jde však o nábojové stavy téže molekuly: [M+H]⁺, [M+2H]²⁺, [M+3H]³⁺. Hodnota m/z každého z nich je (M + n×1.007) ÷ n. Příklad výpočtu pro BPC-157 (průměrná hmotnost 1419.55): jednou nabitý ion se objeví poblíž m/z 1420.6 a dvakrát nabitý poblíž 710.8. U velkého peptidu, jako je semaglutide (4113.58 g/mol), převládají vysoké nábojové stavy – [M+3H]³⁺ poblíž 1372.2 a [M+4H]⁴⁺ poblíž 1029.4 – a dekonvoluční software sloučí celou řadu zpět do jediné neutrální hmotnosti. Pokud dva píky ve spektru odpovídají téže dekonvoluované hmotnosti, jde o jeden druh molekuly. ## Teoretická hmotnost: monoizotopická vs průměrná „Vypočtená“ hmotnost na COA vychází ze sumárního vzorce a existují pro ni dvě konvence. Monoizotopická hmotnost sčítá nejlehčí izotop každého prvku a odpovídá prvnímu píku rozlišeného izotopového klastru – přirozená volba u přístrojů s vysokým rozlišením. Průměrná hmotnost váží izotopy podle jejich přirozeného zastoupení a odpovídá těžišti nerozlišeného klastru. U peptidu o ~1400 Da se obě hodnoty liší zhruba o 1 Da, takže znalost konvence použité v dokumentu předchází planým poplachům. Samotný vzorec se odvozuje ze sekvence včetně modifikací – jak se zapisuje acetylace, [amidace](https://peptidemedixeu.com/cs/glossary/amide-c-terminal-amidation/) a číslování fragmentů, vysvětluje článek o tom, jak číst sekvenci peptidu. ## Diagnostické posuny hmotnosti, které stojí za zapamatování Díky těmto posunům je MS víc než jen kontrola typu vyhověl/nevyhověl: směr a velikost odchylky obvykle prozradí jejího původce. ## Co MS prokazuje a co ne - Prokazuje: že převládající druh má hmotnost zamýšlené molekuly včetně jejích modifikací a u LC-MS také to, že hlavní pík HPLC nese tuto hmotnost. - Samotnou intaktní hmotností neprokazuje: pořadí sekvence. Dva peptidy se stejným složením v jiném pořadí váží stejně; jejich rozlišení vyžaduje fragmentaci (MS/MS), která je vyhrazena charakterizaci, nikoli rutinní kontrole šarží. - Neprokazuje: množství ani procentuální čistotu (účinnost ionizace se mezi druhy liší), obsah vody a protiiontu ani biologickou aktivitu. Čistota zůstává úlohou HPLC – viz vysvětlení čistoty HPLC – a otázky množství patří k čistému obsahu peptidu a molárním výpočtům. ## Jak data MS využít jako kupující 1. Najděte obě čísla. COA by měl výslovně uvádět teoretickou i naměřenou hmotnost. „Vyhovuje“ bez čísel je slabý certifikát. 2. Zkontrolujte shodu a konvenci. Očekávaným standardem je shoda pod jeden dalton při uvedené monoizotopické nebo průměrné konvenci. 3. Ověřte, že jsou zahrnuty modifikace. Teoretická hmotnost acetylovaného, amidovaného nebo lipidovaného peptidu musí modifikaci zohledňovat; COA uvádějící u modifikovaného produktu hmotnost nemodifikovaného skeletu je vnitřně nekonzistentní. 4. Ověřte shodu šarže, jako u každé položky COA – číslo šarže propojuje spektrum s lahvičkou a nezávislé opakované testování podle vysvětlení nezávislého laboratorního testování je nejsilnějším potvrzením, které má výzkumný kupující k dispozici. Každý peptid ve zdejším katalogu lyofilizovaných peptidů v lahvičkách se dodává s potvrzením identity pomocí MS [spolu s čistotou HPLC ≥99%](https://peptidemedixeu.com/cs/learn/hplc-purity-explained/) na COA odpovídajícím dané šarži – obě poloviny kontroly kvality, čtené společně. Rámec prověrky dodavatele kolem nich začíná [kontrolním seznamem pro výběr dodavatele](https://peptidemedixeu.com/cs/learn/choosing-a-peptide-vendor-checklist/). ## Časté dotazy ### Proč čistý peptid vykazuje v hmotnostním spektru více píků? Ionizace elektrosprejem připojuje proměnlivý počet protonů, takže jedna molekula se objeví jako skupina nábojových stavů – [M+H]+, [M+2H]2+, [M+3H]3+ – při různých hodnotách m/z. Dekonvoluční software převede tuto řadu na jedinou neutrální hmotnost. Více píků m/z, které všechny odpovídají téže molekulové hmotnosti, představuje jeden druh, nikoli nečistoty. ### Jak blízko by měla být naměřená a teoretická hmotnost? V rámci uvedené tolerance metody – u rutinní kontroly kvality ve výzkumném měřítku obvykle zlomek daltonu, u přístrojů s vysokým rozlišením ještě méně. Stejně důležitá je konzistence konvence: monoizotopická a průměrná hmotnost se u středně velkého peptidu liší asi o 1 Da, takže zdánlivá odchylka 1 Da je často nesouladem konvencí, nikoli špatnou molekulou. ### Může samotná hmotnostní spektrometrie prokázat sekvenci peptidu? Intaktní hmotnost nikoli: jakékoli přeskupení týchž aminokyselin váží stejně. Intaktní MS prokazuje identitu na úrovni složení – správné stavební bloky a modifikace. Úplné potvrzení sekvence vyžaduje tandemovou MS (MS/MS), při níž se peptid fragmentuje a čte se řada fragmentů. Pro kontrolu kvality při uvolnění šarže je uznávaným standardem intaktní hmotnost spolu s HPLC porovnanou se zavedeným profilem. ### Co znamená posun hmotnosti +16 nebo −18 na COA peptidu? Jde o diagnostické otisky: +16 Da ukazuje na oxidaci, nejčastěji methioninového zbytku, a může vzniknout při skladování i při syntéze. −18 Da ukazuje na ztrátu vody, často tvorbou aspartimidu v motivech aspartát-glycin. Dalšími klasickými případy jsou +42 u nechtěné acetylace a +1 u deamidace. Posun odpovídající známé modifikaci obvykle identifikuje nečistotu bez další práce. ### Je pro identitu peptidu lepší MALDI, nebo ESI? Metody se spíše doplňují, než že by jedna byla lepší. ESI se spojuje s HPLC do LC-MS, což analytikovi umožňuje potvrdit, že hlavní chromatografický pík nese cílovou hmotnost – nejsilnější rutinní propojení čistoty a identity. MALDI-TOF je rychlá, snáší soli a poskytuje jednoduchá spektra jednou nabitých iontů, což z ní činí pracovního koně syntetických laboratoří. COA může legitimně použít kteroukoli z nich; podstatná jsou uvedená čísla a tolerance. ### Řekne mi hmotnostní spektrometrie, kolik peptidu je v lahvičce? Ne. Účinnost ionizace se mezi molekulami liší, takže intenzita píku MS není při rutinní kontrole kvality spolehlivou mírou množství. Na otázky obsahu lahvičky odpovídají gravimetrické údaje o plnění a čistý obsah peptidu (z aminokyselinové analýzy nebo stanovení dusíku) a na otázky koncentrace výpočty rekonstituce, které provedete následně. MS je nástrojem identity, nikoli váhou. --- Výhradně pro laboratorní výzkumné účely. Tato stránka slouží k vědeckým a vzdělávacím informačním účelům. Zde uvedené materiály se prodávají výhradně pro laboratorní výzkum in vitro prováděný kvalifikovanými odborníky — nejsou určeny k humánnímu ani veterinárnímu použití a nic na této stránce nepředstavuje lékařskou radu.