Rozpustnost peptidů: náboj, pH, hydrofobní sekvence a volba rozpouštědla

Peptid je nejméně rozpustný při pH, kdy je jeho čistý náboj nulový, takže prvním krokem při řešení problému s rozpustností je spočítat nabité zbytky v sekvenci a určit, na které straně neutrality se molekula nachází. Rozpustnost peptidů není záhadná vlastnost – vyplývá ze složení a sekvence vám řekne téměř vše potřebné ještě před otevřením lahvičky. Tento průvodce se zabývá výpočtem čistého náboje, izoelektrickým bodem, standardním rozhodovacím stromem pro volbu rozpouštědla, limity hydrofobity a specifickým zacházením, které vyžadují měďnaté komplexy a sekvence obsahující cystein.

Rozpustnost peptidů začíná čistým nábojem

Při pH 7 přispívají k náboji čtyři složky:

• Kladné: lysin (K), arginin (R) a volný N-konec. Histidin (H) je částečně protonován a počítá se zhruba jako +0.1 až +0.5 v závislosti na lokálním prostředí.
• Záporné: aspartát (D), glutamát (E) a volný C-konec.
• Modifikace mění výsledek. N-koncová acetylace odstraňuje koncový kladný náboj; C-koncová amidace odstraňuje koncový záporný náboj. Obě jsou běžné a obě posouvají výsledek o celou jednotku – viz jak číst sekvenci peptidu.

Řešený příklad: BPC-157

BPC-157 je GEPPPGKPADDAGLV, peptid ve formě volné kyseliny bez koncového blokování.

1. Kladné náboje. Jeden lysin (+1) plus volný N-konec (+1) = +2.
2. Záporné náboje. Jeden glutamát a dva aspartáty (−3) plus volný C-konec (−1) = −4.
3. Čistý náboj při pH 7. +2 − 4 = −2. Molekula je při neutrálním pH aniontová, takže její izoelektrický bod leží hluboko pod 7 – u takového složení přibližně při pH 3.5–4.
4. Praktický důsledek. Neutrální voda je zhruba 3 jednotky pH nad pI, s bezpečnou rezervou od zóny minimální rozpustnosti. BPC-157 se snadno rozpouští v bakteriostatické nebo sterilní vodě při jemném kroužení a nepotřebuje žádné korozpouštědlo.

Pro srovnání: silně kationtový peptid

LL-37, lidský katelicidin, nese pět lysinů a šest argininů proti pěti kyselým zbytkům, což dává čistý náboj blízko +6 při pH 7 a pI nad 10. Je vysoce rozpustný ve vodě, ale silně adsorbuje na sklo a na záporně nabité plasty, což znamená, že naměřená koncentrace ve zředěném roztoku může znatelně klesnout, přestože se nic nevysrážilo. Oba typy selhání vypadají ve zkumavce podobně, ale chemicky jsou zcela odlišné.

Pravidlo, které řídí vše

Rozpustnost je minimální přibližně v rozmezí jedné jednotky pH od izoelektrického bodu, protože molekula nenese žádný čistý náboj, a tedy ani žádné elektrostatické odpuzování, které by udrželo její kopie od sebe. Posuňte se alespoň o jednu, lépe o dvě jednotky pH od pI směrem, který sekvence upřednostňuje.

Rozhodovací strom pro volbu rozpouštědla

Proč platí pravidlo „rozpustit v malém, ředit do velkého“

U hydrofobního peptidu vede rozpouštění přímo do velkého vodného objemu ke srážení v místě kontaktu – prášek se setká se špatným rozpouštědlem a lokálně překročí svou rozpustnost dříve, než se stačí rozptýlit. Správné pořadí je opačné: rozpustit v co nejmenším použitelném objemu nejlepšího rozpouštědla, ověřit čirost roztoku a poté pomalu za kroužení přidávat vodné rozpouštědlo. Obrácení tohoto pořadí je nejčastější příčinou nevratně zakalené lahvičky.

Řešený příklad: limity organického korozpouštědla

Předpokládejme, že se hydrofobní peptid o hmotnosti 5 mg čistě rozpustí ve 100 µL DMSO a pracovní roztok musí mít 2 mL.

1. Konečný podíl organické složky. 0.1 mL ÷ 2.0 mL = 5 % DMSO.
2. Je to přijatelné? Většina prací s kulturami savčích buněk toleruje 0.1–0.5 % DMSO a nad přibližně 1 % vykazuje účinky. Při 5 % je rozpouštědlo proměnnou experimentu.
3. Náprava zředěním. Pro dosažení 0.5 % DMSO musí být konečný objem 0.1 ÷ 0.005 = 20 mL, což dává 5 mg ve 20 mL = 0.25 mg/mL.
4. Nebo použijte méně rozpouštědla. Pokud lze peptid převést do roztoku ve 20 µL DMSO, dává konečný objem 2 mL koncentraci 1 % a objem 4 mL 0.5 %. Minimalizace počátečního objemu rozpouštědla stojí za skutečné úsilí.
5. Vždy zařaďte vehikulovou kontrolu se stejnou koncentrací organické složky. Bez ní nelze příspěvek rozpouštědla přiřadit.

Zvláštní případy, které je dobré znát

• Měďnaté peptidy. GHK-Cu drží měď(II) v koordinačním komplexu, který je nejstabilnější v blízkosti neutrálního pH. Kyselá rozpouštědla protonují koordinující dusíky a uvolňují kov; chelátory, jako je EDTA, činí totéž kompeticí. Indikátorem je modrá barva – roztok GHK-Cu, který ztratil barvu, ztratil i měď.
• Cystein a methionin. Thioly snadno oxidují nad pH 8 a za přítomnosti rozpuštěného kyslíku nebo stopových kovů. Pro peptidy s disulfidovými vazbami používejte čerstvě odplyněnou vodu a udržujte roztoky neutrální až mírně kyselé.
• Trifluoroacetátové protiionty. TFA zbylá z purifikace snižuje pH koncentrovaného roztoku a v citlivých testech může být cytotoxická. Tam, kde je test citlivý, se upřednostňují acetátové soli.
• Sekvence náchylné k agregaci. Peptidy bohaté na zbytky tvořící β-listy mohou vytvářet rozpustné oligomery, které projdou filtrem a jsou ve zkumavce neviditelné, přitom se však chovají zcela jinak než monomer.
• Adsorpce, nikoli nerozpustnost. Pod přibližně 10 µg/mL soutěží o peptid stěna nádoby. Řešením jsou nádoby s nízkou vazbou (low-bind) nebo nosičový protein; více rozpouštědla nepomůže.

Praktický postup rozpouštění

1. Uzavřenou lahvičku nechte před otevřením vytemperovat na pokojovou teplotu, aby se k prášku nedostala kondenzace.
2. Zvolené rozpouštědlo přidávejte po stěně lahvičky, nikoli přímo na lyofilizát.
3. Jednu až dvě minuty jemně kružte nebo válejte. Nevortexujte ani netřepejte – smykové síly a rozhraní vzduch–voda podporují agregaci a pěnění.
4. Pokud nerozpuštěný materiál přetrvává, vyčkejte deset minut při pokojové teplotě, než cokoli přidáte. Mnoho lyofilizátů se rozpouští spíše pomalu než neúplně.
5. Je-li roztok stále zakalený, krátce sonikujte v lázni (nikoli sondou) nebo jemně zahřejte na 30–37 °C. Vyhněte se dlouhodobému zahřívání.
6. Teprve poté zvažte úpravu pH nebo přidání korozpouštědla, a to po malých přírůstcích se záznamem každého přídavku.
7. Vyžaduje-li to aplikace, vyčeřte roztok filtrací přes 0.22 µm; u zředěného roztoku filtr předem propláchněte rozpouštědlem.
8. Koncentraci přepočítejte na skutečný konečný objem, nikoli na zamýšlený objem – výpočty najdete v článku o molekulové hmotnosti, molech a molaritě.

Obecný postup rekonstituce najdete v průvodci rekonstitucí a chyby, jimž má tento postup předejít, jsou shrnuty v článku o častých chybách při rekonstituci a skladování.