Spettrometria di massa e conferma dell'identità dei peptidi

La spettrometria di massa conferma l'identità di un peptide pesando la molecola: lo strumento misura il rapporto massa/carica del peptide ionizzato, il software ricostruisce la massa molecolare e tale massa osservata viene confrontata con quella calcolata dalla sequenza prevista. La concordanza entro la tolleranza del metodo (tipicamente una frazione di dalton per il controllo qualità su scala di ricerca) è la prova che il flaconcino contiene la molecola indicata in etichetta. L'HPLC non può fornire questa informazione: un cromatogramma indica quanto il materiale sia omogeneo, mai che cosa sia. In un certificato di analisi, spettrometria di massa e HPLC rispondono quindi a domande complementari, identità e purezza, e questa guida tratta la parte relativa all'identità.

Come si pesa un peptide

Uno spettrometro di massa necessita del peptide sotto forma di ioni in fase gassosa. Due metodi di ionizzazione dominano il controllo qualità dei peptidi:

• ESI (ionizzazione elettrospray). Il peptide disciolto viene nebulizzato attraverso un capillare carico, producendo ioni che portano uno, due, tre o più protoni. L'ESI si accoppia direttamente all'HPLC (LC-MS), motivo per cui è la scelta di routine per i test di rilascio.
• MALDI-TOF. Il peptide viene co-cristallizzato con una matrice che assorbe l'UV e desorbito tramite impulsi laser, per lo più come ioni a carica singola, con la massa misurata dal tempo di volo. Rapido e tollerante ai sali, è comune per i controlli nei laboratori di sintesi.

In entrambi i casi il risultato è uno spettro di picchi massa/carica (m/z) da cui si calcola la massa molecolare neutra.

Leggere uno spettro ESI: gli stati di carica

Lo spettro ESI di un singolo peptide puro mostra di solito diversi picchi, e questo induce chi li legge per la prima volta a vedervi "impurezze". Si tratta invece di stati di carica della stessa molecola: [M+H]⁺, [M+2H]²⁺, [M+3H]³⁺. Il valore m/z di ciascuno è (M + n×1.007) ÷ n. Esempio svolto con BPC-157 (massa media 1419.55): lo ione a carica singola compare intorno a m/z 1420.6 e quello a carica doppia intorno a 710.8. Per un peptide di grandi dimensioni come la semaglutide (4113.58 g/mol) dominano gli stati di carica elevati, [M+3H]³⁺ intorno a 1372.2 e [M+4H]⁴⁺ intorno a 1029.4, e il software di deconvoluzione riconduce la serie a un'unica massa neutra. Se due picchi di uno spettro implicano la stessa massa deconvoluta, sono un'unica specie.

Massa teorica: monoisotopica vs media

La massa "calcolata" riportata su un COA deriva dalla formula molecolare, e le convenzioni sono due. La massa monoisotopica somma l'isotopo più leggero di ciascun elemento e corrisponde al primo picco di un cluster isotopico risolto: è la scelta naturale sugli strumenti ad alta risoluzione. La massa media pesa gli isotopi in base all'abbondanza naturale e corrisponde al centroide di un cluster non risolto. Per un peptide di circa 1400 Da le due differiscono di circa 1 Da, per cui sapere quale convenzione usa un documento evita falsi allarmi. La formula stessa deriva dalla sequenza, modifiche incluse: come si scrivono acetilazione, amidazione e numerazione dei frammenti è spiegato nella guida su come leggere una sequenza peptidica.

Scostamenti di massa diagnostici da memorizzare

Questi scostamenti rendono la spettrometria di massa più di una semplice verifica superato/non superato: direzione ed entità di una discrepanza indicano di solito il responsabile.

Cosa la spettrometria di massa stabilisce e cosa no

• Stabilisce: che la specie dominante ha la massa della molecola prevista, modifiche incluse e, con l'LC-MS, che il picco HPLC principale porta quella massa.
• Non stabilisce con la sola massa intatta: l'ordine della sequenza. Due peptidi con la stessa composizione in ordine diverso pesano uguale; distinguerli richiede la frammentazione (MS/MS), riservata alla caratterizzazione anziché al controllo qualità di routine dei lotti.
• Non stabilisce: quantità o percentuali di purezza (l'efficienza di ionizzazione varia tra le specie), contenuto di acqua e controione, né attività biologica. La purezza resta compito dell'HPLC (si veda la guida alla purezza HPLC) e le questioni di quantità riguardano il contenuto peptidico netto e l'aritmetica molare.

Usare i dati di spettrometria di massa come acquirente

1. Individuare entrambi i valori. Un COA dovrebbe riportare esplicitamente la massa teorica e quella osservata. "Conforme" senza numeri è un certificato debole.
2. Verificare la concordanza e la convenzione. Lo standard atteso è una concordanza inferiore al dalton con una convenzione monoisotopica o media dichiarata.
3. Verificare che le modifiche siano incluse. La massa teorica di un peptide acetilato, amidato o lipidato deve riflettere la modifica; un COA che riporta la massa dello scheletro non modificato per un prodotto modificato è internamente incoerente.
4. Far corrispondere il lotto, come per ogni elemento del COA: il numero di lotto collega lo spettro al flaconcino, e una nuova analisi indipendente, come descritto nella guida ai test di terze parti, è la conferma più solida a disposizione di un acquirente in ambito di ricerca.

Ogni peptide del catalogo di flaconcini liofilizzati viene spedito con conferma dell'identità tramite spettrometria di massa insieme a una purezza HPLC ≥99% sul COA corrispondente al lotto: le due metà del controllo qualità, da leggere insieme. Per il quadro di verifiche che le accompagna, si parta dalla checklist per i fornitori.