O que é o LL-37? Estrutura, mecanismo e panorama da investigação

O LL-37 é o único péptido de defesa do hospedeiro da família das catelicidinas encontrado em seres humanos: uma hélice alfa anfipática e catiónica de 37 resíduos, libertada a partir do terminal C da proteína precursora hCAP18, e o péptido antimicrobiano mais estudado na investigação sobre a imunidade inata humana. O seu nome é literal — duas leucinas iniciais e 37 resíduos. Com 4493,33 g/mol, é de longe o maior péptido do grupo anti-inflamatório deste catálogo, e o seu tamanho, carga e carácter helicoidal determinam tanto os mecanismos descritos como a dificuldade prática de o sintetizar e manusear.

Esta página apresenta a origem da sequência, as características estruturais que determinam o seu comportamento, os mecanismos descritos na literatura, as áreas de investigação em que surge e as especificidades laboratoriais do material. O LL-37 é fornecido sob a forma de pó liofilizado.

Origem e estrutura: do hCAP18 a uma hélice de 37 resíduos

As catelicidinas definem-se por um domínio N-terminal de catelina conservado, ligado a uma região antimicrobiana C-terminal altamente variável. A maioria dos mamíferos possui várias; os seres humanos possuem exatamente um gene, CAMP, cujo produto é a proteína de 18 kDa hCAP18. A proteína é armazenada nos grânulos específicos dos neutrófilos e é também expressa por queratinócitos, células epiteliais das vias respiratórias e do intestino e vários outros tipos celulares. A clivagem proteolítica — principalmente pela proteinase 3 nos neutrófilos e por outras proteases, como as calicreínas na pele — liberta os 37 resíduos C-terminais sob a forma do péptido catelicidina maduro.

Estruturalmente, o péptido é uma hélice anfipática de manual. Em tampão aquoso diluído está maioritariamente desordenado, mas, em contacto com uma superfície aniónica, dobra-se numa hélice em que os resíduos básicos (arginina e lisina) se agrupam numa face e os resíduos hidrofóbicos na outra. Essa segregação é todo o mecanismo em miniatura: a face catiónica proporciona atração eletrostática pelas membranas bacterianas com carga negativa, e a face hidrofóbica insere-se no interior lipídico.

As mesmas propriedades fazem do LL-37 uma molécula difícil de produzir e de manusear. Trinta e sete resíduos constituem uma síntese em fase sólida longa; o segmento hidrofóbico tende a agregar-se na resina; e o péptido acabado adsorve facilmente a superfícies de plástico e vidro. O seu preço relativamente às sequências curtas reflete isso, tal como a necessidade de um manuseamento cuidadoso depois de estar em solução.

Como se pensa que o LL-37 atua

Duas explicações mecanísticas correm em paralelo na literatura, e não estão em concorrência.

Interação direta com a membrana

A descrição clássica é a associação eletrostática aos fosfolípidos aniónicos e ao lipopolissacárido dos invólucros bacterianos, seguida da inserção da hélice e da perda de integridade da membrana. Os modelos propostos incluem a disrupção superficial de tipo «tapete» e a formação de poros toroidais, e diferentes estudos favorecem diferentes geometrias consoante a composição lipídica e a concentração de péptido. Uma vez que o mecanismo é físico-químico e não específico de um alvo, é frequentemente apresentado como menos propenso ao desenvolvimento convencional de resistência do que os antibióticos dirigidos a enzimas — uma hipótese frequentemente enunciada em revisões, e não uma propriedade demonstrada. As membranas dos mamíferos, sendo muito menos aniónicas no folheto externo, são muito menos suscetíveis, o que constitui a base do argumento da seletividade.

Imunomodulação

O segundo conjunto de trabalhos descreve o LL-37 como uma molécula sinalizadora e não como um agente ativo sobre membranas. As atividades descritas incluem o recrutamento quimiotático de neutrófilos, monócitos e células T através do recetor semelhante ao recetor de péptidos formilados 1, a neutralização do lipopolissacárido e a atenuação da cascata inflamatória resultante, a modulação das respostas dos recetores de tipo toll e efeitos sobre a migração de queratinócitos e a angiogénese em modelos de feridas. Às concentrações atingíveis na maioria dos tecidos, vários autores defendem que o papel imunomodulador é o fisiologicamente dominante e que a atividade membranar direta é secundária.

Uma terceira observação, importante, é a dependência do contexto. O LL-37 forma complexos com ADN e ARN próprios que podem desencadear respostas de interferão, trabalho que liga o péptido à investigação sobre doenças cutâneas autoinflamatórias. A mesma molécula que é descrita como protetora num modelo é descrita como motor de patologia noutro, o que é um forte argumento para ler os resultados do LL-37 no contexto específico do modelo utilizado.

O que a investigação examinou

Ensaios antimicrobianos e antibiofilme

As determinações da concentração inibitória mínima contra organismos Gram-positivos e Gram-negativos, os ensaios de permeabilização membranar e os estudos de prevenção e dispersão de biofilmes constituem o maior bloco do trabalho in vitro publicado. Um achado metodológico recorrente é a forte dependência da concentração salina e do teor de soro do ensaio, uma vez que os catiões divalentes e as proteínas séricas competem pela face catiónica do péptido.

Modelos de feridas e de pele

O trabalho celular e em roedores examinou a reepitelização, a migração de queratinócitos e as respostas vasculares, a par da investigação da expressão alterada de catelicidina em doenças cutâneas.

Sinalização imunitária inata

Aqui situam-se os estudos sobre quimiotaxia, neutralização do LPS, fenótipo dos macrófagos e indução de interferão. É neste domínio que o LL-37 é mais frequentemente comparado com outros péptidos de investigação dirigidos ao sistema imunitário, como a timosina alfa-1; os dois são frequentemente confundidos como péptidos imunitários intermutáveis, quando os seus mecanismos são inteiramente diferentes, um contraste abordado em LL-37 vs timosina alfa-1.

Investigação sobre formulação e administração

Uma vez que o péptido adsorve a superfícies e é sensível às proteases, uma literatura aplicada substancial examina análogos truncados, variantes com D-aminoácidos e veículos de administração destinados a conservar a atividade com menos material.

Todo este trabalho é laboratorial e pré-clínico. O LL-37 não tem qualquer utilização aprovada, e os dados em seres humanos limitam-se à investigação em fase inicial de análogos derivados, e não da sequência nativa tal como vendida para investigação.

Formas e formatos que fornecemos

O LL-37 está disponível como pó liofilizado em frascos selados de 5 mg (115 €) e 10 mg (195 €). A aritmética molar é implacável em comparação com os péptidos curtos: a 4493,33 g/mol, um frasco de 5 mg contém apenas cerca de 1,1 micromoles, aproximadamente um treze avos da quantidade molar de um frasco de 5 mg de um tripéptido. Os ensaios que exigem concentrações de trabalho micromolares em volumes razoáveis consomem material rapidamente, que é a razão prática da existência do formato de 10 mg. O material relacionado encontra-se em péptidos anti-inflamatórios e péptidos imunitários; as considerações de compra são abordadas no nosso guia de compra do LL-37.

Reconstituição e armazenamento em contexto laboratorial

O cálculo é simples: um frasco de 5 mg reconstituído com 1 mL de diluente dá 5 mg/mL, ou seja, 5000 mcg/mL e, em termos molares, aproximadamente 1,11 mM. Uma vez que as concentrações de ensaio publicadas se situam habitualmente na gama micromolar baixa, a maior parte do trabalho envolve diluições de várias centenas de vezes.

Há três pontos de manuseamento específicos deste péptido. Primeiro, a adsorção às superfícies é real e mensurável; os tubos e pontas de pipeta de baixa ligação são prática corrente, e o vidro é geralmente preferido ao polipropileno não tratado para soluções-mãe. Segundo, a força iónica do tampão altera a atividade aparente, pelo que o diluente deve ser registado como parte do método e não tratado como acessório. Terceiro, o longo segmento hidrofóbico torna a agregação um risco real: adicione o diluente lentamente pela parede do frasco, rode suavemente em vez de agitar e inspecione a solução contra a luz para detetar turvação antes da utilização. Os frascos liofilizados são conservados a −20 °C ou menos, protegidos da luz e da humidade; a solução reconstituída é dividida em alíquotas e mantida fria, para que um mesmo recipiente não seja repetidamente aquecido e novamente arrefecido. Os pormenores constam do guia de armazenamento de péptidos.

Pureza, COA e como o ler

Cada lote é purificado por HPLC de fase reversa até pelo menos 99%, com confirmação da massa e um certificado associado ao lote. Para um péptido deste comprimento, o certificado contém mais informação do que o habitual, e vale a pena lê-lo com atenção. As sequências de deleção — cadeias a que falta um resíduo — são a impureza característica das sínteses longas, e um péptido a que falte uma única alanina difere em apenas 71 Da do produto de comprimento completo, pelo que tanto o espectro de massa como a resolução cromatográfica são relevantes. Procure um único pico dominante com boa simetria, e não um envelope largo. O teor líquido de péptido é também mais determinante aqui do que em sequências curtas: num péptido fortemente básico fornecido como sal de TFA, o contraião e a água residual podem representar uma parte substancial do peso bruto do frasco, o que tem impacto direto se forem comunicadas concentrações molares. O nosso guia para ler um COA de péptidos percorre estas verificações em documentos reais.

Estatuto regulamentar

O LL-37 é um péptido humano endógeno, mas o material sintético aqui fornecido não é um medicamento aprovado, um suplemento alimentar nem uma preparação manipulada. Não é feita qualquer alegação terapêutica a seu respeito, e nenhum dos resultados antimicrobianos ou imunomoduladores publicados deve ser lido como prova de utilidade clínica.

Péptidos relacionados e leitura adicional

Para a investigação dirigida ao sistema imunitário em termos mais amplos, consulte o panorama sobre péptidos para investigação de suporte imunitário. A timosina alfa-1 e o KPV ocupam posições adjacentes, mas mecanisticamente distintas, no mesmo catálogo, e as listagens de investigação institucionais agrupam o material de defesa do hospedeiro na família do LL-37.