Molekulová hmotnost, moly a molarita peptidových roztoků

Molekulovou hmotnost, moly a molaritu propojují tři vztahy – moly = hmotnost ÷ MW, molarita = moly ÷ litry a C₁V₁ = C₂V₂ pro ředění – a protože molekulová hmotnost v daltonech je číselně totožná s gramy na mol, je každý převod jediným dělením. Koncentraci v mg/mL udává etiketa lahvičky a stříkačka; v molaritě jsou psány protokoly vazby na receptory, enzymové kinetiky i buněčných kultur. Převod mezi nimi je výpočet, který zabrání tomu, aby dva peptidy „o stejné koncentraci“ ve skutečnosti obsahovaly zcela odlišný počet molekul. Tento průvodce prochází každý převod se skutečnými katalogovými molekulovými hmotnostmi, popisuje korekci na čistý obsah peptidu, kterou téměř všichni vynechávají, a končí referenční tabulkou µmol na mg.

Molekulová hmotnost, moly a molarita: tři rovnice

1. Moly z hmotnosti. mol = hmotnost (g) ÷ MW (g/mol). V jednotkách, které peptidová laboratoř skutečně používá: µmol = mg ÷ MW × 1,000, neboli µmol na mg = 1,000 ÷ MW.
2. Molarita z koncentrace. Roztok o x mg/mL má x g/L, takže molarita (mol/L) = (mg/mL) ÷ MW. Vynásobením 1,000 získáte mM, vynásobením 1,000,000 µM.
3. Ředění. C₁V₁ = C₂V₂ v libovolné konzistentní dvojici jednotek. Potřebný objem zásobního roztoku: V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.

Nic dalšího není potřeba. Kalkulačka molarity provede všechny tři výpočty, ale vyplatí se je umět spočítat na papíře, protože právě tak odhalíte kalkulačku s údaji zadanými ve špatných jednotkách.

Příklad výpočtu 1: z lahvičky na molaritu

Vezměme 5 mg lahvičku BPC-157 s molekulovou hmotností 1,419.55 Da.

1. Rekonstituce. 5 mg ve 2 mL rozpouštědla → 5 ÷ 2 = 2.5 mg/mL.
2. Převod. 2.5 mg/mL = 2.5 g/L. Vydělením 1,419.55 g/mol → 0.001761 mol/L = 1.76 mM.
3. Vyjádření v µM, je-li tak protokol psán: 1,761 µM.
4. Kontrola správnosti. µmol na mg u BPC-157 je 1,000 ÷ 1,419.55 = 0.704. Lahvička 5 mg tedy obsahuje 3.52 µmol a 3.52 µmol v 0.002 L odpovídá 1,761 µM. Stejný výsledek jinou cestou.

Příklad výpočtu 2: z molarity na hmotnost

Protokol pro buněčnou kulturu vyžaduje 10 mL pracovního roztoku o koncentraci 100 µM.

1. Potřebné látkové množství. 100 µM = 1 × 10⁻⁴ mol/L. V 0.010 L: 1 × 10⁻⁶ mol = 1 µmol.
2. Potřebná hmotnost. 1 µmol × 1,419.55 g/mol = 1,419.55 µg = 1.42 mg.
3. Nebo příprava ředěním. Ze zásobního roztoku 1.76 mM výše: V₁ = (100 µM × 10 mL) ÷ 1,761 µM = 0.568 mL zásobního roztoku, doplněno na 10 mL.

Druhá cesta je téměř vždy vhodnější – přesně navážit 1.42 mg je obtížnější než napipetovat 0.568 mL a spotřebuje se méně materiálu.

Příklad výpočtu 3: proč stejná hmotnost neznamená stejné látkové množství

Právě tomuto selhání má převod zabránit.

• GHK-Cu, 403.93 Da: 1 mg = 1,000 ÷ 403.93 = 2.476 µmol.
• Semaglutide, 4,113.58 Da: 1 mg = 1,000 ÷ 4,113.58 = 0.243 µmol.

Tentýž miligram GHK-Cu poskytuje 10.2krát více molekul než miligram semaglutide. Jakékoli srovnání dvou peptidů formulované v mg/mL z hlediska obsazenosti receptorů porovnává různé počty částic. Směs v hmotnostním poměru 1:1 má uvnitř stejný problém, a proto je u stechiometrické práce podstatné srovnání směsí a samostatných lahviček.

Příklad výpočtu 4: korekce na čistý obsah peptidu

Syntetické peptidy se izolují jako soli, takže lahvička označená 5 mg obsahuje 5 mg prášku – peptid plus protiion plus zbytkovou vodu a rozpouštědlo. Čistý obsah peptidu (net peptide content) se obvykle pohybuje mezi 70–90 % a měl by být uveden na certifikátu.

1. Bez korekce. 5 mg ve 2 mL → 2.5 mg/mL → 1.761 mM, jak je uvedeno výše.
2. S korekcí při čistém obsahu peptidu 85 %. Skutečný peptid = 5 × 0.85 = 4.25 mg. Ve 2 mL → 2.125 mg/mL. Vydělením 1,419.55 → 1.497 mM.
3. Chyba. (1.761 − 1.497) ÷ 1.761 = o 15 % výše, přenesená do každého následného ředění a každé uváděné koncentrace.
4. Náprava. Buď opravte výpočet, nebo rekonstituujte korigovaným objemem: k dosažení přesně 2.5 mg/mL peptidu z lahvičky obsahující 4.25 mg přidejte 4.25 ÷ 2.5 = 1.70 mL místo 2 mL.

U kvalitativní práce korekce jen zřídka změní závěr. U čehokoli, co uvádí IC₅₀, EC₅₀ nebo vazebnou konstantu, znamená její opomenutí systematickou chybu 15–30 %. Jak tento údaj najít, popisuje článek o nezávislém laboratorním testování.

Referenční tabulka: µmol na miligram

Pokud molekulová hmotnost není uvedena na etiketě, lze ji vypočítat ze sekvence – sečtěte průměrné hmotnosti zbytků a přičtěte 18.02 Da, jak popisuje článek o tom, jak číst sekvenci peptidu.

Pasti v jednotkách, které stojí za zapamatování

• 1 mg/mL = 1 g/L. Záměna o faktor 1,000 je nejčastější jednotlivou chybou.
• 1 mg = 1,000 mcg. Etikety lahviček používají mg; pracovní koncentrace se často uvádějí v mcg/mL. Právě k tomu slouží převodník jednotek.
• mM, µM a nM se od sebe liší vždy o 1,000. Práce s buněčnými kulturami se obvykle pohybuje v µM nebo nM; rekonstituovaná lahvička obvykle v mM.
• Daltony a g/mol jsou totéž číslo. Peptid o 1,419.55 Da má 1,419.55 g/mol.
• Přidaný objem není konečný objem. Přidáním 2 mL rozpouštědla k lyofilizátu vznikne o něco více než 2 mL roztoku; u hmotností peptidu v řádu několika miligramů je vytěsnění zanedbatelné, přestává však být zanedbatelné zhruba nad 50 mg na lahvičku.
• Měď a další komplexy. Hodnota 403.93 Da u GHK-Cu zahrnuje ion mědi. Výpočet pouze ze sekvence volného tripeptidu dává 340.4 Da a chybu 19 %.

Pro stránku téhož problému týkající se mg/mL a hodnot na jednotku – volbu objemu rozpouštědla tak, aby rutinní odběry vycházely na čitelné značky stříkačky – viz vysvětlení matematiky rekonstituce a kalkulačku rekonstituce.