Masa cząsteczkowa, mole i molarność roztworów peptydów

Masę cząsteczkową, mole i molarność łączą trzy zależności – mole = masa ÷ MW, molarność = mole ÷ litry oraz C₁V₁ = C₂V₂ dla rozcieńczeń – a ponieważ masa cząsteczkowa w daltonach jest liczbowo tożsama z gramami na mol, każde przeliczenie sprowadza się do jednego dzielenia. Stężenie w mg/mL to wartość, którą daje etykieta fiolki i strzykawka; molarność to język, w którym pisane są protokoły wiązania receptorowego, kinetyki enzymatycznej i hodowli komórkowych. Przeliczanie między nimi to obliczenie, które zapobiega sytuacji, w której dwa peptydy „o tym samym stężeniu” zawierają skrajnie różne liczby cząsteczek. Niniejszy przewodnik przechodzi przez każde przeliczenie z rzeczywistymi katalogowymi masami cząsteczkowymi, omawia korektę na zawartość czystego peptydu, którą niemal wszyscy pomijają, i kończy się tabelą referencyjną µmol na mg.

Masa cząsteczkowa, mole i molarność: trzy równania

1. Mole z masy. mol = masa (g) ÷ MW (g/mol). W jednostkach faktycznie używanych w laboratorium peptydowym: µmol = mg ÷ MW × 1000 lub równoważnie µmol na mg = 1000 ÷ MW.
2. Molarność ze stężenia. Roztwór o stężeniu x mg/mL to x g/L, zatem molarność (mol/L) = (mg/mL) ÷ MW. Pomnożyć przez 1000, aby otrzymać mM, i przez 1 000 000, aby otrzymać µM.
3. Rozcieńczenie. C₁V₁ = C₂V₂, w dowolnej spójnej parze jednostek. Objętość potrzebnego roztworu podstawowego: V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.

Nic więcej nie jest potrzebne. Kalkulator molarności wykona wszystkie trzy działania, ale warto umieć przeprowadzić te obliczenia na papierze, bo tylko w ten sposób wychwytuje się dane wprowadzone do kalkulatora w niewłaściwych jednostkach.

Przykład 1: od fiolki do molarności

Weźmy fiolkę 5 mg BPC-157 o masie cząsteczkowej 1419,55 Da.

1. Rekonstytucja. 5 mg w 2 mL rozpuszczalnika → 5 ÷ 2 = 2,5 mg/mL.
2. Przeliczenie. 2,5 mg/mL = 2,5 g/L. Podzielić przez 1419,55 g/mol → 0,001761 mol/L = 1,76 mM.
3. Wyrazić w µM, jeśli protokół tak to zapisuje: 1761 µM.
4. Kontrola rozsądku. µmol na mg dla BPC-157 wynosi 1000 ÷ 1419,55 = 0,704. Fiolka 5 mg zawiera zatem 3,52 µmol, a 3,52 µmol w 0,002 L to 1761 µM. Ten sam wynik uzyskany inną drogą.

Przykład 2: od molarności do masy

Protokół hodowli komórkowej wymaga 10 mL roztworu roboczego o stężeniu 100 µM.

1. Wymagana liczba moli. 100 µM = 1 × 10⁻⁴ mol/L. W 0,010 L: 1 × 10⁻⁶ mol = 1 µmol.
2. Wymagana masa. 1 µmol × 1419,55 g/mol = 1419,55 µg = 1,42 mg.
3. Albo przygotować przez rozcieńczenie. Z powyższego roztworu podstawowego 1,76 mM: V₁ = (100 µM × 10 mL) ÷ 1761 µM = 0,568 mL roztworu podstawowego, uzupełnione do 10 mL.

Druga droga jest niemal zawsze lepsza – dokładne odważenie 1,42 mg jest trudniejsze niż odpipetowanie 0,568 mL i powoduje mniejsze straty materiału.

Przykład 3: dlaczego równa masa to nie równa liczba moli

To właśnie ten rodzaj błędu ma eliminować przeliczanie.

• GHK-Cu, 403,93 Da: 1 mg = 1000 ÷ 403,93 = 2,476 µmol.
• Semaglutide, 4113,58 Da: 1 mg = 1000 ÷ 4113,58 = 0,243 µmol.

Ten sam miligram GHK-Cu dostarcza 10,2 razy więcej cząsteczek niż miligram semaglutide. Każde porównanie dwóch peptydów wyrażone w mg/mL zestawia – z punktu widzenia zajętości receptora – różne liczby cząsteczek. Mieszanka o stosunku masowym 1:1 ma ten sam problem wewnętrznie, dlatego wybór między mieszankami a pojedynczymi fiolkami ma znaczenie w pracach stechiometrycznych.

Przykład 4: korekta na zawartość czystego peptydu

Peptydy syntetyczne izoluje się w postaci soli, więc fiolka oznaczona jako 5 mg zawiera 5 mg proszku – peptyd wraz z przeciwjonem oraz resztkową wodą i rozpuszczalnikiem. Zawartość czystego peptydu (net peptide content) wynosi zwykle 70–90% i powinna być podana w certyfikacie.

1. Bez korekty. 5 mg w 2 mL → 2,5 mg/mL → 1,761 mM, jak wyżej.
2. Z korektą przy 85% zawartości czystego peptydu. Rzeczywista ilość peptydu = 5 × 0,85 = 4,25 mg. W 2 mL → 2,125 mg/mL. Podzielone przez 1419,55 → 1,497 mM.
3. Błąd. (1,761 − 1,497) ÷ 1,761 = zawyżenie o 15%, przenoszone na każde kolejne rozcieńczenie i każde raportowane stężenie.
4. Rozwiązanie. Albo skorygować obliczenie, albo zrekonstytuować skorygowaną objętością: aby uzyskać dokładnie 2,5 mg/mL peptydu z fiolki zawierającej 4,25 mg, należy dodać 4,25 ÷ 2,5 = 1,70 mL zamiast 2 mL.

W pracach jakościowych korekta rzadko zmienia wniosek. W przypadku każdego wyniku podającego IC₅₀, EC₅₀ lub stałą wiązania jej pominięcie oznacza błąd systematyczny rzędu 15–30%. Sposób odszukania tej wartości omówiono w objaśnieniu badań przez stronę trzecią.

Tabela referencyjna: µmol na miligram

Gdy masy cząsteczkowej nie ma na etykiecie, można ją obliczyć z sekwencji – zsumować średnie masy reszt i dodać 18,02 Da, zgodnie z opisem w artykule o odczytywaniu sekwencji peptydu.

Pułapki jednostek warte zapamiętania

• 1 mg/mL = 1 g/L. Pomylenie tego o czynnik 1000 jest najczęstszym pojedynczym błędem.
• 1 mg = 1000 mcg. Etykiety fiolek używają mg; stężenia robocze podaje się często w mcg/mL. Właśnie po to istnieje przelicznik jednostek.
• mM, µM i nM różnią się o 1000 każde. Prace na hodowlach komórkowych zwykle operują w µM lub nM; zrekonstytuowana fiolka zwykle w mM.
• Daltony i g/mol to ta sama liczba. Peptyd o masie 1419,55 Da ma 1419,55 g/mol.
• Dodana objętość to nie objętość końcowa. Dodanie 2 mL rozpuszczalnika do liofilizatu daje nieco więcej niż 2 mL roztworu; przy kilku miligramach peptydu wyparta objętość jest pomijalna, ale przestaje być pomijalna powyżej mniej więcej 50 mg na fiolkę.
• Miedź i inne kompleksy. Masa 403,93 Da dla GHK-Cu obejmuje jon miedzi. Obliczenie z samej sekwencji wolnego tripeptydu daje 340,4 Da i błąd 19%.

Stronę zagadnienia dotyczącą mg/mL i przeliczeń na jednostki – czyli dobór objętości rozpuszczalnika tak, aby rutynowe pobrania wypadały na czytelnych kreskach strzykawki – omówiono w artykule matematyka rekonstytucji oraz w kalkulatorze rekonstytucji.