Peso molecolare, moli e molarità per le soluzioni peptidiche

Peso molecolare, moli e molarità sono collegati da tre relazioni (moli = massa ÷ PM, molarità = moli ÷ litri e C₁V₁ = C₂V₂ per le diluizioni) e, poiché il peso molecolare in dalton è numericamente identico ai grammi per mole, ogni conversione si riduce a una singola divisione. La concentrazione in mg/mL è ciò che forniscono l'etichetta di un flaconcino e una siringa; la molarità è l'unità in cui sono scritti i protocolli di legame recettoriale, di cinetica enzimatica e di coltura cellulare. Convertire dall'una all'altra è l'operazione che impedisce a due peptidi "alla stessa concentrazione" di trovarsi in realtà a numeri di molecole enormemente diversi. Questa guida sviluppa ogni conversione con pesi molecolari reali di catalogo, tratta la correzione per il contenuto peptidico netto che quasi tutti trascurano e si conclude con una tabella di riferimento in µmol per mg.

Peso molecolare, moli e molarità: le tre equazioni

1. Moli dalla massa. mol = massa (g) ÷ PM (g/mol). Nelle unità effettivamente usate in un laboratorio di peptidi: µmol = mg ÷ PM × 1,000, o in modo equivalente µmol per mg = 1,000 ÷ PM.
2. Molarità dalla concentrazione. Una soluzione a x mg/mL corrisponde a x g/L, quindi molarità (mol/L) = (mg/mL) ÷ PM. Moltiplicare per 1,000 per ottenere mM, per 1,000,000 per ottenere µM.
3. Diluizione. C₁V₁ = C₂V₂, in qualsiasi coppia coerente di unità. Risolvere per il volume di soluzione madre necessario: V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.

Non serve altro. Il calcolatore di molarità esegue tutte e tre le operazioni, ma vale la pena saper fare i calcoli su carta, perché è così che si individua un calcolatore compilato con le unità sbagliate.

Esempio pratico 1: dal flaconcino alla molarità

Si consideri un flaconcino di BPC-157 da 5 mg, peso molecolare 1,419.55 Da.

1. Ricostituire. 5 mg in 2 mL di diluente → 5 ÷ 2 = 2.5 mg/mL.
2. Convertire. 2.5 mg/mL = 2.5 g/L. Dividere per 1,419.55 g/mol → 0.001761 mol/L = 1.76 mM.
3. Esprimere in µM se il protocollo è scritto in tale unità: 1,761 µM.
4. Verifica di plausibilità. Le µmol per mg di BPC-157 sono 1,000 ÷ 1,419.55 = 0.704. Il flaconcino da 5 mg contiene quindi 3.52 µmol, e 3.52 µmol in 0.002 L corrispondono a 1,761 µM. Stessa risposta per una via diversa.

Esempio pratico 2: dalla molarità alla massa

Un protocollo di coltura cellulare richiede 10 mL di una soluzione di lavoro a 100 µM.

1. Moli necessarie. 100 µM = 1 × 10⁻⁴ mol/L. In 0.010 L: 1 × 10⁻⁶ mol = 1 µmol.
2. Massa necessaria. 1 µmol × 1,419.55 g/mol = 1,419.55 µg = 1.42 mg.
3. Oppure prepararla per diluizione. Dalla soluzione madre da 1.76 mM di cui sopra: V₁ = (100 µM × 10 mL) ÷ 1,761 µM = 0.568 mL di soluzione madre, portati a 10 mL.

La seconda via è quasi sempre preferibile: pesare con precisione 1.42 mg è più difficile che pipettare 0.568 mL, e si spreca meno materiale.

Esempio pratico 3: perché massa uguale non significa moli uguali

È proprio l'errore che la conversione serve a prevenire.

• GHK-Cu, 403.93 Da: 1 mg = 1,000 ÷ 403.93 = 2.476 µmol.
• Semaglutide, 4,113.58 Da: 1 mg = 1,000 ÷ 4,113.58 = 0.243 µmol.

Lo stesso milligrammo di GHK-Cu fornisce 10.2 volte più molecole di un milligrammo di semaglutide. Qualsiasi confronto tra due peptidi espresso in mg/mL, ai fini dell'occupazione recettoriale, confronta numeri diversi di entità. Una miscela con rapporto di massa 1:1 presenta lo stesso problema al proprio interno, ed è per questo che il confronto tra miscele e flaconcini singoli è importante per il lavoro stechiometrico.

Esempio pratico 4: la correzione per il contenuto peptidico netto

I peptidi di sintesi sono isolati come sali, per cui un flaconcino etichettato 5 mg contiene 5 mg di polvere: peptide più controione più acqua e solvente residui. Il contenuto peptidico netto è in genere del 70–90% e dovrebbe essere indicato nel certificato.

1. Senza correzione. 5 mg in 2 mL → 2.5 mg/mL → 1.761 mM, come sopra.
2. Con correzione all'85% di contenuto peptidico netto. Peptide effettivo = 5 × 0.85 = 4.25 mg. In 2 mL → 2.125 mg/mL. Dividere per 1,419.55 → 1.497 mM.
3. L'errore. (1.761 − 1.497) ÷ 1.761 = 15% in eccesso, propagato in ogni diluizione successiva e in ogni concentrazione riportata.
4. La soluzione. Correggere il calcolo oppure ricostituire con il volume corretto: per ottenere esattamente 2.5 mg/mL di peptide da un flaconcino che ne contiene 4.25 mg, aggiungere 4.25 ÷ 2.5 = 1.70 mL anziché 2 mL.

Per il lavoro qualitativo la correzione cambia raramente una conclusione. Per qualsiasi lavoro che riporti un IC₅₀, un EC₅₀ o una costante di legame, ignorarla significa un errore sistematico del 15–30%. Come reperire il valore è spiegato nella guida ai test di terze parti.

Tabella di riferimento: µmol per milligrammo

Quando il peso molecolare non è riportato in etichetta, può essere calcolato dalla sequenza sommando le masse medie dei residui e aggiungendo 18.02 Da, come illustrato in come leggere una sequenza peptidica.

Trappole sulle unità da ricordare

• 1 mg/mL = 1 g/L. Invertire questa relazione di un fattore 1,000 è l'errore singolo più comune.
• 1 mg = 1,000 mcg. Le etichette dei flaconcini usano i mg; le concentrazioni di lavoro sono spesso espresse in mcg/mL. Il convertitore di unità esiste proprio per questo.
• mM, µM e nM differiscono ciascuno di un fattore 1,000. Il lavoro su colture cellulari si svolge di solito in µM o nM; un flaconcino ricostituito si colloca di solito nell'ordine dei mM.
• Dalton e g/mol sono lo stesso numero. Un peptide da 1,419.55 Da corrisponde a 1,419.55 g/mol.
• Il volume aggiunto non è il volume finale. Aggiungere 2 mL di diluente a un cake liofilizzato produce poco più di 2 mL di soluzione; per masse peptidiche di pochi milligrammi lo spostamento è trascurabile, ma smette di esserlo oltre circa 50 mg per flaconcino.
• Rame e altri complessi. I 403.93 Da di GHK-Cu includono lo ione rame. Calcolando dalla sola sequenza del tripeptide libero si ottengono 340.4 Da e un errore del 19%.

Per il lato mg/mL e per unità dello stesso problema (scegliere un volume di diluente tale che i prelievi di routine cadano su tacche leggibili della siringa), si vedano i calcoli di ricostituzione spiegati e il calcolatore di ricostituzione.