Jak číst sekvenci peptidu: jednopísmenné a třípísmenné kódy, modifikace, amidace

Sekvence peptidu se zapisuje od N-konce vlevo po C-konec vpravo pomocí jednopísmenných nebo třípísmenných kódů aminokyselin, přičemž případná chemická modifikace se píše jako předpona nebo přípona na tom konci, jehož se týká. Naučit se číst sekvenci peptidu trvá asi deset minut a je to nejrychlejší způsob, jak ověřit lahvičku oproti jejímu certifikátu analýzy: sekvence kóduje identitu, předpovídá molekulovou hmotnost a vysvětluje většinu toho, jak se molekula chová v roztoku. Tento průvodce popisuje oba kódovací systémy, konvence směru, zkratky modifikací, s nimiž se na výzkumných etiketách skutečně setkáte, a příklad výpočtu, který ze sekvence získá molekulovou hmotnost porovnatelnou s COA. Vše níže popsané se týká laboratorního referenčního materiálu.

Směr: proč záleží na pořadí od N ke C

Aminokyseliny se spojují prostřednictvím peptidové vazby vznikající mezi karboxylovou skupinou jednoho zbytku a aminoskupinou následujícího. Tato reakce je směrová, takže řetězec má dva chemicky odlišné konce: volnou aminoskupinu (N-konec) a volnou karboxylovou skupinu (C-konec). Podle univerzální konvence se N-konec píše jako první. Gly-Glu-Pro a Pro-Glu-Gly jsou různé molekuly se stejným složením a stejnou hmotností a samotný hmotnostní spektrometr je nerozliší, a proto se potvrzení identity pomocí MS obvykle spojuje s uvedenou sekvencí, nikoli ji nahrazuje.

Číslování zbytků se řídí stejným směrem. Pokud etiketa uvádí HGH Fragment 176-191, čísla odkazují na pozice počítané od N-konce mateřského proteinu o 191 zbytcích; fragment tvoří 16 zbytků na těchto pozicích, nikoli samostatně navržená sekvence.

Jak číst sekvenci peptidu: jednopísmenné a třípísmenné kódy

Třípísmenné kódy jsou čitelné a jednoznačné, proto převládají na etiketách produktů a v COA. Jednopísmenné kódy jsou úsporné a převládají v databázích, publikacích a objednávkových formulářích syntézy. Oba popisují stejných dvacet proteinogenních zbytků.

Leucin a isoleucin mají stejnou hmotnost, protože jde o strukturní izomery. Tato jediná skutečnost vysvětluje opakující se frustraci v analytice peptidů: standardní hmotnostní spektrometrie nedokáže rozlišit L od I, takže jejich přiřazení se opírá o záznam syntézy a chromatografické chování, nikoli jen o hmotnost.

Čtení skutečné etikety

BPC-157 je v katalogu uveden jako Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-Asp-Ala-Gly-Leu-Val, což v jednopísmenném kódu je GEPPPGKPADDAGLV. Patnáct zbytků, odtud „pentadekapeptid“. Tři po sobě jdoucí proliny poblíž N-konce dávají řetězci tuhý ohyb a dva sousední aspartáty nesou při neutrálním pH záporný náboj – obojí jsou strukturní fakta, která lze přímo vyčíst ze sekvence, a obojí je relevantní pro chování při rozpouštění.

Zkratky modifikací

Většina výzkumných peptidů nejsou prosté nemodifikované řetězce. Zápis je však konzistentní, jakmile jej znáte.

• Ac- na levém konci znamená N-terminální acetylaci: volná aminoskupina je zakončena acetylovou skupinou, což přidává 42.04 Da a odstraňuje kladný náboj. TB-500 se zapisuje Ac-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln, tj. Ac-LKKTETQ.
• -NH2 na pravém konci znamená C-terminální amidaci: koncová skupina -OH je nahrazena -NH2, což ubírá 0.98 Da a odstraňuje záporný náboj. Mnoho přirozených signálních peptidů je in vivo amidováno a amid je obvykle nezbytný pro aktivitu na receptoru – oxytocin se zapisuje Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2.
• D- před zbytkem označuje D-enantiomer, jako D-Trp v GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2). D-zbytky mají stejnou hmotnost jako jejich L-protějšky, ale jsou špatnými substráty savčích proteáz, proto se záměrně vkládají ke zpomalení degradace.
• Nestandardní zbytky se uvádějí názvem. Aib je kyselina α-aminoisomáselná, zbytek stabilizující šroubovici a odolný vůči proteázám, používaný v Ipamorelinu (Aib-His-D-2-Nal-D-Phe-Lys-NH2) a na pozici 2 skeletu GLP-1 u semaglutide a tirzepatide. 2-Nal je 2-naftylalanin.
• Hranaté závorky a horní indexy označují substituce vůči mateřské sekvenci, např. [D-Ala²] znamená, že pozice 2 byla nahrazena D-alaninem.
• Cyklizace se znázorňuje čarou, obalem „cyclo(...)“ nebo uvedeným disulfidem Cys–Cys. Cys1 a Cys6 oxytocinu tvoří disulfidový můstek uzavírající kruh o šesti zbytcích; tato vazba je citlivá na redukci a představuje skutečný faktor při skladování.

Příklad výpočtu: ze sekvence na molekulovou hmotnost

Molekulová hmotnost je součtem hmotností zbytků plus 18.02 Da za molekulu vody uvolněnou při tvorbě řetězce, následně upraveným o modifikace. Dva příklady s katalogovými hodnotami:

1. KPV (Lys-Pro-Val). 128.17 + 97.12 + 99.13 = 324.42. Přičtením 18.02 → 342.44 Da. Katalog uvádí 342.43; rozdíl 0.01 je dán zaokrouhlením v tabulce zbytků.
2. Epitalon (Ala-Glu-Asp-Gly, AEDG). 71.08 + 129.12 + 115.09 + 57.05 = 372.34. Přičtením 18.02 → 390.36 Da oproti katalogovým 390.35.
3. Přidání modifikace. Acetylovaná a amidovaná verze téhož tetrapeptidu by měla 390.36 + 42.04 − 0.98 = 431.42 Da.

Očekávaným výsledkem je shoda v rozmezí asi 0.1 %. Odchylka 18 Da obvykle znamená, že někdo zapomněl na člen za vodu; 42 Da, že byla opomenuta acetylová skupina; 1 Da, že byl přehlédnut amid. Jakmile máte spolehlivou molekulovou hmotnost, můžete převádět mezi hmotností a moly pro přípravu pufrů – výpočty popisuje článek o molekulové hmotnosti, molech a molaritě a kalkulačka molarity.

Sekvence na COA versus sekvence v katalogu

Katalogová položka uvádí zamýšlenou sekvenci. COA uvádí, co bylo naměřeno: pozorovanou monoizotopickou nebo průměrnou hmotnost z MS a údaj o čistotě z HPLC na reverzní fázi. Žádná z těchto technik nečte sekvenci zbytek po zbytku, pokud nejsou dodána data z fragmentace MS/MS, což je u běžných komerčních certifikátů neobvyklé. Uvedenou sekvenci berte jako prohlášení výrobce a naměřenou hmotnost jako její kontrolu.

Časté chyby při čtení

• Čtení od C ke N. Obrácením sekvence vznikne jiná molekula (retro-peptid) se stejnou hmotností. Vždy ověřte, že zbytek zcela vlevo je N-konec.
• Považování solné formy za součást sekvence. Protiionty trifluoracetát nebo acetát nejsou zbytky; přidávají hmotnost obsahu lahvičky, nikoli peptidu. To je obvyklý důvod, proč navážené množství prášku obsahuje méně peptidu, než naznačuje hmotnost na etiketě, a proč obsah soli TFA patří do COA.
• Předpoklad, že číslování fragmentu odpovídá jeho délce. „176-191“ znamená 16 zbytků, nikoli 191.
• Opomíjení amidu. Sekvence aktivní pouze ve své amidované formě je jiným výzkumným reagens než verze s volnou kyselinou, přestože se obě liší o jediný dalton.
• Záměna směsí za jednotlivé sekvence. Společně formulovaná lahvička, jako je KLOW Blend, obsahuje čtyři sekvence a nemá jedinou molekulovou hmotnost; viz směsi vs samostatné lahvičky.

Pokud se sekvence, uvedená molekulová hmotnost a naměřená hmotnost z MS shodují, máte rozumný důkaz, že lahvička obsahuje to, co uvádí etiketa. Pokud se neshodují, je sekvence téměř vždy nejrychlejším místem, kde zjistit proč.