Co je Humanin? Struktura, cytoprotektivní mechanismus a přehled výzkumu

Humanin je peptid o 24 aminokyselinách kódovaný v mitochondriálním genomu — konkrétně v genu MT-RNR2, v oblasti 16S ribozomální RNA — a byl vůbec prvním identifikovaným peptidem mitochondriálního původu. Nevzešel z prohledávání databází. Byl nalezen v roce 2001 v knihovně cDNA připravené z okcipitálního kortexu mozku postiženého Alzheimerovou chorobou, vybraného proto, že neurony této oblasti přežily, a byl izolován screeningem faktorů, které chránily buňky před toxicitou amyloidu beta. Tato cesta objevu vysvětluje, proč je literatura o humaninu zaměřena spíše na cytoprotekci než na metabolismus.

Peptide Medix EU dodává Humanin jako lyofilizovaný prášek v lahvičkách o obsahu 5 mg a 10 mg v rámci sortimentu mitochondriálních peptidů.

Co je Humanin?

Humanin patří do malé rodiny peptidů mitochondriálního původu: krátkých otevřených čtecích rámců uložených uvnitř genů ribozomální RNA v kruhové mitochondriální DNA o velikosti 16.5 kilobází, jejichž produkty jsou detekovatelné v tkáních a plazmě. Jeho sekvence je Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala, s číslem CAS 330936-69-1, sumárním vzorcem C119H204N34O32S2 a molekulovou hmotností 2,687.27 g/mol.

Chování materiálu v laboratoři ovlivňují tři zbytky v této sekvenci. Řada čtyř po sobě jdoucích leucinů v pozicích 9 až 12 vytváří silně hydrofobní úsek, který omezuje rozpustnost ve vodě a podporuje agregaci. Cystein v pozici 8 nese volný thiol, který může tvořit intermolekulární disulfidy a při stání vytvářet dimery. A N-koncový methionin je náchylný k oxidaci. Nic z toho neztěžuje práci s peptidem, znamená to však, že na zacházení záleží více než u typického krátkého peptidu.

Původ a struktura

Identifikace, kterou provedla skupina Nishimota v Tokiu, využila funkční screening: knihovna cDNA byla transfekována do buněk vystavených produktu genu familiární Alzheimerovy choroby a poté byly vyhledány klony, které přežily. Přeživší klon kódoval humanin. Protože otevřený čtecí rámec leží v mitochondriální DNA, může být humanin translatován na mitochondriálních ribozomech s mitochondriálním genetickým kódem a byla popsána i jaderně kódovaná varianta translatovaná v cytosolu — obě se liší v jedné pozici a literatura ne vždy výslovně uvádí, kterou z nich daná studie použila.

Analogy s modifikovanou sekvencí se v literatuře objevují všude a často jsou tím, co článek ve skutečnosti studoval. Nejznámější je HNG, v němž je serin 14 nahrazen glycinem; v testech ochrany byl popsán jako o řády účinnější než mateřská sekvence. Hlodavčí homolog, rattin, je delší než lidský peptid. Pečlivé čtení literatury o humaninu znamená ověřit, která molekula je uvedena v metodice.

Jak Humanin pravděpodobně působí

Jsou popisovány dvě mechanistické cesty a, což je u peptidu této velikosti neobvyklé, působí na opačných stranách buněčné membrány.

Extracelulární cesta vede přes receptorový komplex. U humaninu byla popsána vazba na trimerní receptor tvořený receptorem ciliárního neurotrofního faktoru, WSX-1 a gp130, se signalizací dráhou JAK/STAT3. Samostatné práce popsaly vazbu na receptor podobný receptoru formylpeptidů 1 (FPR2), receptor spřažený s G proteinem, na který se váže také amyloid beta — věrohodná cesta ke kompetitivní interferenci na tomto receptoru.

Intracelulární cestou je interakce protein–protein. U humaninu byla popsána vazba na Bax a blokování jeho translokace z cytosolu na vnější mitochondriální membránu, což je rozhodující krok vnitřní apoptózy; podobné interakce byly popsány s Bid a s proteinem vážícím IGF 3. Tato větev vyžaduje, aby byl peptid uvnitř buňky, což jeho hydrofobní jádro věrohodně umožňuje.

Obě cesty se sbíhají ve stejném popisovaném výsledku — snížené apoptotické signalizaci při stresu — a proto je humanin v literatuře popisován jako cytoprotektivní, nikoli jako metabolický či trofický. Která větev v daném modelu převažuje, není vyřešeno, a uvádět pro humanin jediný definitivní mechanismus by přeceňovalo publikované výsledky.

Co výzkum zkoumal

Přežívání neuronů a amyloidové modely

Zakládající a stále nejrozsáhlejší literatura zkoumá ochranu kultivovaných neuronů před toxicitou amyloidu beta a před produkty genů familiární Alzheimerovy choroby a zasahuje i do modelů poruch paměti u hlodavců, v nichž byl peptid nebo HNG podáván centrálně. Jde o práce na buňkách a zvířatech.

Metabolické a inzulinové studie

Práce na hlodavcích zkoumaly nakládání s glukózou a citlivost na inzulin, s popsanými účinky na hypotalamickou signalizaci a jaterní produkci glukózy. V observačních studiích u lidí byla popsána také korelace cirkulujícího humaninu s ukazateli citlivosti na inzulin.

Kohorty stárnutí a dlouhověkosti

Podle publikovaných údajů plazmatický humanin s věkem klesá u lidí i u několika živočišných druhů a je vyšší v některých dlouhověkých kohortách a u potomků stoletých. Jde o asociační data.

Kardiovaskulární a endoteliální modely

Studie v modelech ischemie–reperfuze, aterosklerózy a endoteliálních buněk popsaly snížení apoptotických markerů a zachovanou funkci, což odpovídá cytoprotektivnímu rámci.

Co není prokázáno

Neexistují žádné kontrolované studie podávaného humaninu u lidí a žádný schválený přípravek. Velká část nejsilnějších publikovaných dat využívala HNG, nikoli nativní sekvenci, což je skutečná výhrada při interpretaci výsledků pro mateřský peptid. Pozadí rodiny popisuje článek o humaninu a rodině peptidů mitochondriálního původu a přímé srovnání článek humanin vs MOTS-c.

Rekonstituce a skladování v laboratorním kontextu

Humanin je z peptidů v této nabídce nejobtížněji převeditelný do roztoku a důvodem je řada leucinů. Obvyklým rozpouštědlem je bakteriostatická nebo sterilní voda a produkt může vyžadovat mírné zahřátí a dobu stání; některé publikované protokoly peptid nejprve rozpouštějí v malém objemu DMSO a poté ředí do vodného pufru. Rozpouštědlo se přidává po stěně lahvičky a lahvičkou se krouží a nechá se stát, nikoli třepe — míchání hydrofobního peptidu podporuje právě tu agregaci, které je třeba se vyhnout. Roztok, který zůstává zakalený, se zcela nerozpustil a nelze předpokládat, že má nominální koncentraci.

Výpočet je laboratorní: lahvička o obsahu 10 mg doplněná 2 mL rozpouštědla dává 5 mg/mL, tj. 5,000 mcg/mL, takže 0.1 mL — značka 10 jednotek na stříkačce U-100 — obsahuje 500 mcg. Při 2,687.27 g/mol odpovídá 1 mg přibližně 0.37 µmol. Podrobnosti metody jsou v našem průvodci rekonstitucí.

Lyofilizované lahvičky se uchovávají při −20 °C, uzavřené a chráněné před světlem a vlhkostí. Rekonstituovaný materiál se uchovává při 2–8 °C po dobu časového okna studie nebo se rozdělí na alikvoty a zmrazí; volný thiol cysteinu činí tvorbu dimerů při stání reálnou možností, proto je čerstvě připravený roztok vhodnější než dlouho uchovávaný zásobní roztok. Širší praxe je popsána v článku o tom, jak skladovat peptidy.

Čistota, COA a jak je číst

Kontrolou identity je výsledek hmotnostní spektrometrie odpovídající 2,687.27 g/mol. Právě u této sekvence stojí za to hledat dvě satelitní hmotnosti. Pík při +16 Da ukazuje na oxidaci N-koncového methioninu. Pík přibližně při dvojnásobku mateřské hmotnosti minus 2 Da ukazuje na dimer spojený disulfidem vzniklý přes cystein v pozici 8 — formu, která se bude v testu chovat odlišně a kterou samotné procento čistoty nezachytí, pokud koeluuje. Na záznamu HPLC dává hydrofobní 24-mer širší pík než malý polární peptid, takže tvar píku je třeba posuzovat vzhledem k tomuto očekávání, nikoli vzhledem k ideálnímu chromatogramu. Náš průvodce čtením certifikátu peptidu analýzy popisuje zbývající části.

Regulační status

Humanin nemá nikde registraci jako léčivý přípravek, nemá referenční přípravek ani schválené informace o přípravku a není doplňkem stravy. V žádné formě pro něj neexistuje schválené použití.

Příbuzné peptidy a další četba

Dalším mitochondriálně kódovaným peptidem v širokém výzkumném použití je MOTS-c z oblasti 12S rRNA, jehož popisovaný mechanismus je spíše metabolický než cytoprotektivní. SS-31 (Elamipretide) není mitochondriálně kódován vůbec, jde o navržený tetrapeptid, který se koncentruje na vnitřní membráně. Širší orientaci nabízí náš přehled peptidů pro výzkum energie a mitochondrií.