O que é a Humanin? Estrutura, mecanismo citoprotetor e panorama da investigação

A Humanin é um péptido de 24 aminoácidos codificado no genoma mitocondrial — especificamente no gene MT-RNR2, a região do ARN ribossómico 16S — e foi o primeiro péptido de origem mitocondrial alguma vez identificado. Não resultou de uma pesquisa em bases de dados. Foi encontrada em 2001 numa biblioteca de cDNA obtida a partir do córtex occipital de um cérebro com doença de Alzheimer, escolhida porque os neurónios dessa região tinham sobrevivido, e foi isolada por rastreio de fatores que protegiam as células da toxicidade do beta-amiloide. Essa via de descoberta explica porque é que a literatura sobre a Humanin está enquadrada em torno da citoproteção e não do metabolismo.

A Peptide Medix EU fornece a Humanin como pó liofilizado em frascos de 5 mg e 10 mg, na gama de péptidos mitocondriais.

O que é a Humanin?

A Humanin pertence a uma pequena família de péptidos de origem mitocondrial: grelhas de leitura aberta curtas localizadas nos genes do ARN ribossómico do círculo mitocondrial de 16,5 quilobases, cujos produtos são detetáveis em tecidos e no plasma. A sua sequência é Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala, com o número CAS 330936-69-1, a fórmula molecular C119H204N34O32S2 e a massa molecular de 2687,27 g/mol.

Três características dessa sequência determinam o comportamento do material em laboratório. A série de quatro leucinas consecutivas nas posições 9 a 12 cria um troço fortemente hidrofóbico que limita a solubilidade aquosa e favorece a agregação. A cisteína na posição 8 tem um tiol livre, que pode formar dissulfuretos intermoleculares e produzir dímeros em repouso. E a metionina N-terminal é propensa à oxidação. Nada disto torna o péptido difícil de trabalhar, mas significa que o manuseamento importa mais do que num péptido curto típico.

Origem e estrutura

A identificação, pelo grupo de Nishimoto em Tóquio, recorreu a um rastreio funcional: transfetar uma biblioteca de cDNA em células expostas ao produto de um gene da doença de Alzheimer familiar e, em seguida, encontrar os clones que sobrevivem. O clone sobrevivente codificava a Humanin. Como a grelha de leitura aberta se situa no ADN mitocondrial, a Humanin pode ser traduzida em ribossomas mitocondriais com o código genético mitocondrial, e foi também descrita uma variante de codificação nuclear traduzida no citosol — as duas diferem numa posição, e a literatura nem sempre explicita qual delas foi usada num dado estudo.

Os análogos com sequência modificada surgem ao longo de toda a literatura e são frequentemente o que um artigo efetivamente estudou. O mais conhecido é o HNG, no qual a serina 14 é substituída por glicina; foi descrito como várias ordens de grandeza mais potente do que a sequência de origem em ensaios de proteção. Um homólogo de roedor, a rattin, é mais longo do que o péptido humano. Ler com cuidado a literatura sobre a Humanin implica verificar que molécula consta da secção de métodos.

Como se pensa que a Humanin atua

São descritas duas vias mecanísticas e, invulgarmente para um péptido deste tamanho, operam em lados opostos da membrana celular.

A via extracelular passa por um complexo de recetores. A Humanin foi descrita como ligando-se a um recetor trimérico composto pelo recetor do fator neurotrófico ciliar, pelo WSX-1 e pela gp130, sinalizando através da via JAK/STAT3. Outro trabalho descreveu a ligação ao recetor 1 semelhante ao recetor de péptidos formilados (FPR2), um recetor acoplado a proteína G também ativado pelo beta-amiloide — uma via plausível de interferência competitiva nesse recetor.

A via intracelular é a interação proteína–proteína. A Humanin foi descrita como ligando-se à Bax e bloqueando a sua translocação do citosol para a membrana mitocondrial externa, o passo decisivo da apoptose intrínseca; foram descritas interações semelhantes com a Bid e com a proteína de ligação ao IGF 3. Este braço requer que o péptido esteja no interior da célula, o que o seu núcleo hidrofóbico plausivelmente permite.

Ambas as vias convergem no mesmo resultado descrito — redução da sinalização apoptótica sob stress —, razão pela qual a Humanin é descrita na literatura como citoprotetora e não como metabólica ou trófica. Qual dos braços predomina em cada modelo não está esclarecido, e afirmar um único mecanismo definitivo para a Humanin sobrevalorizaria o registo publicado.

O que a investigação examinou

Sobrevivência neuronal e modelos de amiloide

A literatura fundadora, e ainda a mais extensa, examina a proteção de neurónios em cultura contra a toxicidade do beta-amiloide e contra produtos de genes da doença de Alzheimer familiar, estendendo-se a modelos de roedores de défice de memória nos quais o péptido ou o HNG foram administrados centralmente. Trata-se de trabalho celular e animal.

Estudos metabólicos e de insulina

Trabalho em roedores examinou o processamento da glicose e a sensibilidade à insulina, com efeitos descritos na sinalização hipotalâmica e na produção hepática de glicose. A Humanin circulante foi também descrita como correlacionada com medidas de sensibilidade à insulina em estudos observacionais em humanos.

Envelhecimento e coortes de longevidade

A Humanin plasmática foi descrita como diminuindo com a idade em humanos e em várias espécies animais, e como sendo mais elevada em algumas coortes de longa vida e nos descendentes de centenários. Trata-se de dados de associação.

Modelos cardiovasculares e endoteliais

Estudos em modelos de isquemia-reperfusão, aterosclerose e células endoteliais descreveram redução de marcadores apoptóticos e preservação da função, coerentes com o enquadramento citoprotetor.

O que não está estabelecido

Não existem ensaios controlados em humanos com Humanin administrada nem qualquer produto aprovado. Grande parte dos dados publicados mais sólidos utilizou o HNG e não a sequência nativa, o que é uma ressalva genuína ao interpretar resultados para o péptido de origem. O enquadramento da família está em «A Humanin e a família dos péptidos de origem mitocondrial», e a comparação direta em Humanin vs MOTS-c.

Reconstituição e armazenamento em contexto laboratorial

A Humanin é o péptido desta prateleira menos simples de pôr em solução, e a série de leucinas é a razão. A água bacteriostática ou a água estéril são os solventes habituais, e o produto pode necessitar de aquecimento suave e de tempo de repouso; alguns protocolos publicados dissolvem primeiro o péptido num pequeno volume de DMSO e depois diluem-no em tampão aquoso. O solvente é adicionado pela parede do frasco, e o frasco é rodado suavemente e deixado em repouso em vez de agitado — agitar um péptido hidrofóbico favorece exatamente a agregação que se pretende evitar. Uma solução que permaneça turva não se dissolveu completamente e não se deve presumir que está na concentração nominal.

A aritmética é um cálculo laboratorial: um frasco de 10 mg perfeito com 2 mL de diluente dá 5 mg/mL, ou 5000 mcg/mL, pelo que 0,1 mL — a marca das 10 unidades numa seringa U-100 — contêm 500 mcg. Com 2687,27 g/mol, 1 mg corresponde a aproximadamente 0,37 µmol. Os pormenores do método estão no nosso guia de reconstituição.

Os frascos liofilizados são mantidos a −20 °C, selados e protegidos da luz e da humidade. O material reconstituído é mantido a 2–8 °C durante a janela do estudo ou dividido em alíquotas e congelado; o tiol livre da cisteína torna a formação de dímeros em repouso uma possibilidade real, pelo que é preferível uma solução preparada no momento a uma solução-mãe mantida durante muito tempo. A prática mais ampla está em «Como armazenar péptidos».

Pureza, COA e como o ler

A verificação de identidade é um resultado de espectrometria de massa coincidente com 2687,27 g/mol. Vale a pena procurar duas massas satélite específicas desta sequência. Um pico a +16 Da indica oxidação da metionina N-terminal. Um pico a cerca do dobro da massa de origem, menos 2 Da, indica um dímero ligado por dissulfureto formado através da cisteína na posição 8 — uma espécie que se comportará de forma diferente num ensaio e que uma percentagem de pureza, por si só, não assinalará se coeluir. No cromatograma de HPLC, um 24-mero hidrofóbico dá um pico mais largo do que um péptido polar pequeno, pelo que a forma do pico deve ser avaliada face a essa expectativa e não face a um cromatograma ideal. O nosso guia sobre como ler um certificado de análise de péptidos aborda as restantes secções.

Estatuto regulamentar

A Humanin não tem autorização de introdução no mercado como medicamento em lado nenhum, nem produto de referência nem rotulagem aprovada, e não é um suplemento alimentar. Não existe qualquer utilização aprovada em qualquer forma.

Péptidos relacionados e leituras adicionais

O outro péptido de codificação mitocondrial amplamente utilizado em investigação é o MOTS-c, da região do ARNr 12S, cujo mecanismo descrito é metabólico e não citoprotetor. O SS-31 (Elamipretide) não é de todo codificado mitocondrialmente, mas sim um tetrapéptido concebido que se concentra na membrana interna. Uma orientação mais ampla encontra-se na nossa visão geral dos péptidos para investigação em energia e mitocôndrias.