Czym jest Humanin? Budowa, mechanizm cytoprotekcyjny i przegląd badań

Humanin to 24-aminokwasowy peptyd kodowany w genomie mitochondrialnym — konkretnie w genie MT-RNR2, w regionie 16S rybosomalnego RNA — i był to pierwszy zidentyfikowany peptyd pochodzenia mitochondrialnego. Nie odkryto go w wyniku przeszukiwania baz danych. Znaleziono go w 2001 roku w bibliotece cDNA sporządzonej z kory potylicznej mózgu osoby z chorobą Alzheimera, wybranej dlatego, że neurony tego regionu przetrwały, a wyizolowano go w ramach przesiewu w poszukiwaniu czynników chroniących komórki przed toksycznością amyloidu beta. Ta droga odkrycia wyjaśnia, dlaczego literatura na temat humaniny koncentruje się na cytoprotekcji, a nie na metabolizmie.

Peptide Medix EU dostarcza Humanin w postaci liofilizowanego proszku w fiolkach 5 mg i 10 mg w ramach asortymentu peptydów mitochondrialnych.

Czym jest Humanin?

Humanin należy do niewielkiej rodziny peptydów pochodzenia mitochondrialnego: krótkich otwartych ramek odczytu zlokalizowanych w genach rybosomalnego RNA 16,5-kilozasadowego kolistego genomu mitochondrialnego, których produkty są wykrywalne w tkankach i osoczu. Jego sekwencja to Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala, numer CAS 330936-69-1, wzór cząsteczkowy C119H204N34O32S2, a masa cząsteczkowa 2,687.27 g/mol.

Trzy reszty w tej sekwencji decydują o zachowaniu materiału w laboratorium. Ciąg czterech kolejnych leucyn w pozycjach 9–12 tworzy silnie hydrofobowy odcinek, który ogranicza rozpuszczalność w wodzie i sprzyja agregacji. Cysteina w pozycji 8 zawiera wolną grupę tiolową, która może tworzyć międzycząsteczkowe mostki disiarczkowe i prowadzić do powstawania dimerów podczas przechowywania. Z kolei N-końcowa metionina jest podatna na utlenianie. Nic z tego nie czyni peptydu trudnym w pracy, ale oznacza, że sposób postępowania ma większe znaczenie niż w przypadku typowego krótkiego peptydu.

Pochodzenie i budowa

Identyfikacja, dokonana przez zespół Nishimoto w Tokio, opierała się na przesiewie funkcjonalnym: bibliotekę cDNA transfekowano do komórek poddanych działaniu produktu genu związanego z rodzinną postacią choroby Alzheimera, a następnie wyszukiwano klony, które przeżyły. Klon, który przetrwał, kodował humaninę. Ponieważ otwarta ramka odczytu znajduje się w mitochondrialnym DNA, humanina może być translowana na rybosomach mitochondrialnych z użyciem mitochondrialnego kodu genetycznego; opisano również wariant kodowany jądrowo, translowany w cytozolu — oba różnią się w jednej pozycji, a literatura nie zawsze jasno wskazuje, którego z nich użyto w danym badaniu.

Analogi o zmodyfikowanej sekwencji pojawiają się w całej literaturze i często to właśnie je faktycznie badano. Najbardziej znany jest HNG, w którym seryna 14 została zastąpiona glicyną; według doniesień jest on o rzędy wielkości silniejszy od sekwencji macierzystej w testach ochronnych. Homolog u gryzoni, rattin, jest dłuższy od peptydu ludzkiego. Uważna lektura literatury o humaninie wymaga sprawdzenia, jaka cząsteczka została wskazana w części metodycznej.

Jak prawdopodobnie działa Humanin

Opisano dwie drogi mechanistyczne i — co nietypowe dla peptydu tej wielkości — działają one po przeciwnych stronach błony komórkowej.

Droga zewnątrzkomórkowa przebiega przez kompleks receptorowy. Według doniesień humanina wiąże się z trimerycznym receptorem złożonym z receptora rzęskowego czynnika neurotroficznego, WSX-1 i gp130, przekazując sygnał szlakiem JAK/STAT3. W odrębnych pracach opisano wiązanie z receptorem podobnym do receptora peptydów formylowanych 1 (FPR2) — receptorem sprzężonym z białkiem G, z którym oddziałuje również amyloid beta — co stanowi prawdopodobną drogę kompetycyjnej interferencji na tym receptorze.

Droga wewnątrzkomórkowa polega na oddziaływaniach białko–białko. Według doniesień humanina wiąże Bax i blokuje jego translokację z cytozolu do zewnętrznej błony mitochondrialnej, co jest etapem przesądzającym o wewnętrznej ścieżce apoptozy; podobne oddziaływania opisano z Bid oraz z białkiem wiążącym IGF 3. To ramię wymaga, by peptyd znalazł się wewnątrz komórki, na co prawdopodobnie pozwala jego hydrofobowy rdzeń.

Obie drogi prowadzą do tego samego opisywanego efektu — osłabienia sygnalizacji apoptotycznej w warunkach stresu — i dlatego w literaturze humaninę określa się jako cytoprotekcyjną, a nie metaboliczną czy troficzną. Które ramię dominuje w danym modelu, pozostaje niewyjaśnione, a wskazanie jednego definitywnego mechanizmu humaniny byłoby przecenieniem opublikowanych danych.

Co badano

Przeżywalność neuronów i modele amyloidowe

Literatura założycielska, wciąż najobszerniejsza, dotyczy ochrony hodowanych neuronów przed toksycznością amyloidu beta i produktami genów rodzinnej postaci choroby Alzheimera, a także modeli gryzoni z zaburzeniami pamięci, w których peptyd lub HNG podawano ośrodkowo. Są to badania na komórkach i zwierzętach.

Badania metaboliczne i insulinowe

W badaniach na gryzoniach analizowano gospodarkę glukozą i wrażliwość na insulinę, opisując wpływ na sygnalizację podwzgórzową i wątrobową produkcję glukozy. W obserwacyjnych badaniach u ludzi opisano również korelację stężenia krążącej humaniny ze wskaźnikami wrażliwości na insulinę.

Kohorty dotyczące starzenia i długowieczności

Według doniesień stężenie humaniny w osoczu zmniejsza się z wiekiem u ludzi i kilku gatunków zwierząt, a w niektórych długowiecznych kohortach oraz u potomstwa stulatków jest wyższe. Są to dane asocjacyjne.

Modele sercowo-naczyniowe i śródbłonkowe

W badaniach w modelach niedokrwienia–reperfuzji, miażdżycy i komórek śródbłonka opisano zmniejszenie markerów apoptozy i zachowanie funkcji, co jest zgodne z ujęciem cytoprotekcyjnym.

Czego nie ustalono

Nie przeprowadzono kontrolowanych badań klinicznych z podawaniem humaniny ludziom i nie istnieje żaden zatwierdzony produkt. Znaczna część najmocniejszych opublikowanych danych dotyczy HNG, a nie sekwencji natywnej, co stanowi istotne zastrzeżenie przy interpretacji wyników dla peptydu macierzystego. Tło dotyczące całej rodziny przedstawiono w artykule o humaninie i rodzinie peptydów pochodzenia mitochondrialnego, a bezpośrednie porównanie w artykule humanina vs MOTS-c.

Rekonstytucja i przechowywanie w warunkach laboratoryjnych

Humanin jest najmniej oczywistym peptydem w tej grupie, jeśli chodzi o doprowadzenie do roztworu, a przyczyną jest ciąg leucyn. Zwykle stosowanym rozpuszczalnikiem jest woda bakteriostatyczna lub woda sterylna, a produkt może wymagać delikatnego ogrzania i czasu na rozpuszczenie; w niektórych opublikowanych protokołach peptyd rozpuszcza się najpierw w niewielkiej objętości DMSO, a następnie rozcieńcza buforem wodnym. Rozpuszczalnik dodaje się po ściance fiolki, a fiolkę delikatnie obraca i odstawia zamiast nią wstrząsać — mieszanie hydrofobowego peptydu sprzyja właśnie tej agregacji, której należy unikać. Roztwór, który pozostaje mętny, nie jest w pełni rozpuszczony i nie należy zakładać, że ma nominalne stężenie.

Obliczenia mają charakter laboratoryjny: fiolka 10 mg uzupełniona 2 mL rozpuszczalnika daje 5 mg/mL, czyli 5,000 mcg/mL, zatem 0.1 mL — znacznik 10 jednostek na strzykawce U-100 — zawiera 500 mcg. Przy 2,687.27 g/mol 1 mg odpowiada około 0.37 µmol. Szczegóły metody opisano w naszym przewodniku po rekonstytucji.

Fiolki z liofilizatem przechowuje się w temperaturze −20 °C, zamknięte i chronione przed światłem i wilgocią. Materiał po rekonstytucji przechowuje się w temperaturze 2–8 °C przez okres badania lub dzieli na porcje i zamraża; wolna grupa tiolowa cysteiny sprawia, że tworzenie dimerów podczas przechowywania jest realną możliwością, dlatego świeżo przygotowany roztwór jest korzystniejszy od długo przechowywanego roztworu podstawowego. Szersze zasady opisano w artykule o przechowywaniu peptydów.

Czystość, COA i jak go czytać

Kontrolą tożsamości jest wynik spektrometrii mas zgodny z wartością 2,687.27 g/mol. W przypadku tej sekwencji warto szukać dwóch mas satelitarnych. Pik przy +16 Da wskazuje na utlenienie N-końcowej metioniny. Pik przy mniej więcej dwukrotności masy macierzystej minus 2 Da wskazuje na dimer połączony mostkiem disiarczkowym, utworzony przez cysteinę w pozycji 8 — formę, która zachowa się inaczej w teście i której sam procent czystości nie ujawni, jeśli będzie się współeluować. Na chromatogramie HPLC hydrofobowy 24-mer daje szerszy pik niż mały peptyd polarny, dlatego kształt piku należy oceniać względem tego oczekiwania, a nie względem idealnego chromatogramu. Pozostałe sekcje omawia nasz przewodnik po czytaniu certyfikatu analizy peptydu.

Status regulacyjny

Humanin nie ma nigdzie pozwolenia na dopuszczenie do obrotu jako lek, nie ma produktu referencyjnego ani zatwierdzonej charakterystyki i nie jest suplementem diety. Nie ma żadnego zatwierdzonego zastosowania w jakiejkolwiek postaci.

Powiązane peptydy i dalsza lektura

Drugim peptydem kodowanym mitochondrialnie, szeroko stosowanym w badaniach, jest MOTS-c z regionu 12S rRNA, którego opisywany mechanizm ma charakter metaboliczny, a nie cytoprotekcyjny. SS-31 (Elamipretide) w ogóle nie jest kodowany mitochondrialnie — to zaprojektowany tetrapeptyd gromadzący się przy błonie wewnętrznej. Szerszy kontekst przedstawia nasz przegląd peptydów w badaniach nad energią i mitochondriami.