Peptydy znakowane fluorescencyjnie, biotyną i radioizotopami: do czego służy każdy znacznik

Peptydy znakowane to zwykłe sekwencje z dołączoną grupą reporterową, a wybór znacznika zależy od posiadanego już przyrządu detekcyjnego – fluorescencja do obrazowania i testów wiązania na płytkach, biotyna do wychwytu i amplifikacji enzymatycznej, radiojod dla najwyższej czułości w badaniach receptorowych i immunologicznych. Każdy znacznik dodaje masę, może wymagać łącznika i może zaburzyć wiązanie, jeśli zostanie przyłączony do niewłaściwego końca. Niniejszy przewodnik omawia przeznaczenie każdej rodziny znaczników, masę, jaką każdy z nich dodaje (co pozwala zweryfikować wynik tożsamości), praktyczne ograniczenia każdego z nich oraz obliczenie rozpadu dla materiału radioznakowanego.

Znaczniki fluorescencyjne

Pochodne fluoresceiny są wyborem domyślnym, ponieważ ich długości fal wzbudzenia i emisji odpowiadają zestawom filtrów praktycznie każdego czytnika płytek, mikroskopu i cytometru przepływowego zbudowanego w ciągu ostatnich trzydziestu lat. Dominują dwa zastosowania:

• Testy wiązania oparte na polaryzacji fluorescencji. Mały znakowany peptyd szybko rotuje i depolaryzuje emitowane światło; związany z dużym receptorem lub przeciwciałem rotuje wolno, a polaryzacja rośnie. Odczyt jest homogeniczny – bez etapu rozdzielania – co czyni tę metodę podstawowym narzędziem wiązania kompetycyjnego.
• Substraty proteaz typu FRET. Fluorofor donorowy i wygaszacz flankują miejsce cięcia. W nienaruszonej cząsteczce emisja jest wygaszona; po cięciu fragmenty się rozdzielają i sygnał rośnie. Projekt wymaga, by enzym tolerował obie pozycje znaczników.

Warto jasno wskazać dwa praktyczne ograniczenia. Emisja fluoresceiny gwałtownie spada poniżej pH 7, ponieważ fluoryzuje forma fenolanowa, więc znakowany peptyd w kwaśnym buforze może wydawać się nieobecny, choć jest jedynie „ciemny”. Ponadto fluorofory ulegają fotowybielaniu – roztwory podstawowe należy przechowywać w ciemności, ograniczać ekspozycję podczas odczytów i uwzględniać dołek referencyjny z tego samego dnia.

Znaczniki biotynowe

Wartość biotyny wynika z powinowactwa oddziaływania biotyna–streptawidyna, o stałej dysocjacji około 10⁻¹⁴ M – w normalnych warunkach testu praktycznie nieodwracalnego. Pozwala to unieruchomić biotynylowany peptyd na płytce lub kulce opłaszczonej streptawidyną i intensywnie płukać bez strat, a także amplifikować detekcję za pomocą koniugatu streptawidyna–enzym – to ta sama chemia, na której opierają się formaty kanapkowe w ofercie zestawów do oznaczeń.

Powracającym pytaniem projektowym jest łącznik. Biotyna przyłączona bezpośrednio do krótkiego peptydu znajduje się na tyle blisko sekwencji, że kieszeń wiążąca streptawidyny i własny partner wiązania peptydu konkurują sterycznie. Wstawienie łącznika z kwasu aminoheksanowego (Ahx) – 113.2 Da na jednostkę, czasem dwie – odsuwa biotynę o około 10–20 Å i zwykle przywraca oba oddziaływania. Jeśli biotynylowany peptyd słabo się wychwytuje, łącznik jest pierwszą rzeczą do sprawdzenia.

Przykład obliczeniowy: weryfikacja znakowanego peptydu na podstawie masy

1. Wyjść od masy nieznakowanej. Semax to Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro o masie 813.93 Da.
2. Dodać znacznik 5-FAM. Karboksyfluoresceina sprzęga się wiązaniem amidowym z utratą wody, dodając około 358 Da: 813.93 + 358 = ≈1172 Da.
3. Zamiast tego dodać biotynę z jednym łącznikiem Ahx. 813.93 + 226.3 + 113.2 = ≈1153 Da.
4. Porównać z certyfikatem. Zaobserwowana masa równa wartości nieznakowanej oznacza, że sprzęganie się nie powiodło; wartość o 358 Da wyższa od oczekiwanej dla peptydu znakowanego pojedynczo oznacza przyłączenie drugiego znacznika. Metodę odczytu tych wyników opisano w artykule o spektrometrii mas i tożsamości peptydów.
5. Przeliczyć molarność. Znacznik jest częścią cząsteczki, więc obliczenia molowe muszą uwzględniać masę znakowaną – 1172 zamiast 814 to różnica 44%. Zob. masa cząsteczkowa, mole i molarność.

Radioznaczniki

Jod-125 pozostaje najczulszym rutynowo dostępnym znacznikiem w pracy z peptydami. Wprowadza się go na reszty tyrozyny lub histydyny, wykrywa w liczniku gamma bez substratu ani etapu amplifikacji, a jego teoretyczna maksymalna aktywność właściwa wynosi około 2176 Ci/mmol przy jednym atomie jodu na cząsteczkę. Ta czułość sprawia, że wiązanie radioligandów pozostaje metodą referencyjną, względem której waliduje się fluorescencyjne testy wiązania, oraz że radioimmunoanaliza utrzymuje się w badaniach neuropeptydów – w dużej części skatalogowanych w dziale badań neuropeptydów – tam, gdzie ELISA nie osiąga wymaganej granicy wykrywalności.

Przykład obliczeniowy: rozpad i okno użyteczności

1. Okres półtrwania. I-125 rozpada się z okresem półtrwania 59.4 dnia.
2. Po 30 dniach. Pozostała aktywność = 0.5 do potęgi (30 ÷ 59.4) = 0.704. Preparat o aktywności 100 µCi ma teraz 70.4 µCi.
3. Po 120 dniach. 0.5 do potęgi (120 ÷ 59.4) = 0.247 – około jednej czwartej pierwotnej aktywności i praktyczny koniec okna użyteczności większości testów wiązania.
4. Konsekwencja dla projektu. Statystyka zliczeń stale się pogarsza, więc aktywność właściwą należy przeliczać przy każdym użyciu, a nie przyjmować z certyfikatu wysyłkowego, a długie badania czasowe muszą uwzględniać zmianę między pierwszą a ostatnią płytką.

Peptydy radioznakowane wiążą się też z obowiązkami dotyczącymi zezwoleń, przechowywania, monitorowania i utylizacji, których nie mają alternatywy fluorescencyjne i biotynylowane, a radioliza powoli uszkadza sam peptyd. W przypadku wielu pytań dotyczących wiązania format polaryzacji fluorescencji jest obecnie wyborem pragmatycznym; dla najniższych granic wykrywalności radiojod wciąż wygrywa.

Gdzie przyłączyć znacznik

• Znakować koniec, który nie jest farmakoforem. Wiele peptydów sygnałowych wiąże się przez koniec C – zwłaszcza peptydy amidowane – dlatego znakowanie N-końcowe jest zwykle wyborem domyślnym. Gdy istotny jest koniec N, jak w przypadku peptydów rozpoznawanych przez receptory wrażliwe na aminopeptydazy, wybór się odwraca.
• Znakowanie łańcucha bocznego przez grupę ε-aminową lizyny jest możliwe, ale daje mieszaninę, chyba że w sekwencji jest dokładnie jedna lizyna, a mieszaniny zachowują się niespójnie.
• Zawsze porównywać z nieznakowanym związkiem macierzystym w tym samym teście. Znacznik, który zmienia powinowactwo dziesięciokrotnie, po cichu unieważnia eksperyment.
• Należy spodziewać się niższych specyfikacji czystości. Znakowanie dodaje etap sprzęgania i drugie oczyszczanie, a peptydy znakowane są zwykle zwalniane z nieco niższą czystością niż ich nieznakowane odpowiedniki.

Przechowywanie i obchodzenie się

• Przechowywać w postaci liofilizowanej, w temperaturze −20 °C lub niższej, w ciemności. Fluorofory są wrażliwe na światło zarówno w stanie stałym, jak i w roztworze.
• Chronić fluorescencyjne roztwory podstawowe przed wielokrotnym ogrzewaniem; porcjować przy pierwszej rekonstytucji.
• Podczas odczytów utrzymywać peptydy znakowane fluoresceiną w pH 7 lub wyższym i rejestrować pH buforu wraz z sygnałem.
• Materiałem radioznakowanym posługiwać się wyłącznie w ramach obowiązującego zezwolenia, z monitoringiem dozymetrycznym i wydzielonymi ścieżkami odpadów.

Oferta peptydów znakowanych i struktura jej katalogu są opisane w artykule o peptydach znakowanych: czym są i jak je wybierać; można je przeglądać w dziale peptydów znakowanych katalogu badawczego.