Molecule guides
Zestawy ELISA, EIA i RIA: czym są i jak je wybierać
Jak wybrać zestaw do oznaczania peptydów: ELISA, EIA czy RIA, test kanapkowy czy kompetycyjny, zakres wzorców, matryca próbki, gatunek i zasady pobierania.
Zestawy ELISA, EIA i RIA odpowiadają na jedno pytanie: ile danego peptydu znajduje się w próbce. Każdy zestaw w sekcji zestawów do oznaczeń łączy dopasowane przeciwciało, skalibrowany wzorzec, system detekcji i zwalidowany zakres stężeń w jedną zwalidowaną procedurę — dlatego zakup zestawu jest niemal zawsze szybszy i bardziej powtarzalny niż samodzielne składanie przeciwciała, znacznika i wzorców. O tym, czy zestaw sprawdzi się na danych próbkach, decyduje jego specyfikacja, a nie marka.
ELISA, EIA i RIA: porównanie trzech formatów
Definicje słownikowe: ELISA i RIA. Wybór formatu zależy głównie od wielkości peptydu. Test kanapkowy wymaga dwóch przeciwciał wiążących się jednocześnie z nienakładającymi się epitopami, czego peptyd o dziesięciu resztach nie jest w stanie pomieścić — dlatego krótkie peptydy oznacza się metodą kompetycyjną, a testy kompetycyjne mają odwróconą krzywą wzorcową, na której wysoki sygnał oznacza niskie stężenie analitu.
Parametry specyfikacji decydujące o przydatności zestawu
Na pierwszym miejscu są zakres wzorców i czułość. Przed wszystkim innym należy porównać zakres zestawu z oczekiwanymi stężeniami: zestaw do osocza skalibrowany w zakresie pikogramowym ulegnie wysyceniu przy stężonym supernatancie hodowli komórkowej, a zestaw o szerokim zakresie może nie rozróżnić różnic na dolnym krańcu pomiaru w osoczu gryzoni. Czułość, zwykle podawana jako minimalne wykrywalne stężenie, wyznacza dolną granicę.
Na drugim miejscu jest rodzaj próbki. Zestawy są walidowane na określonych matrycach — surowicy, osoczu z EDTA lub heparyną, moczu, płynie mózgowo-rdzeniowym, ekstrakcie tkankowym, supernatancie hodowli komórkowej — a efekty matrycy są realne: składniki surowicy mogą zakłócać wiązanie przeciwciał w sposób, którego wzorce w buforze nie odtwarzają. Użycie zwalidowanej matrycy albo przeprowadzenie testu odzysku dodatku (spike-recovery) i liniowości rozcieńczeń na matrycy niezwalidowanej stanowi różnicę między wiarygodnymi liczbami a artefaktami.
Na trzecim miejscu jest gatunek — najczęstsza przyczyna bezużytecznych danych w pracach metabolicznych. Zestaw do oznaczania insuliny lub leptyny kalibrowany dla człowieka systematycznie podaje błędne wyniki dla próbek gryzoni. Reaktywność gatunkową należy sprawdzić dla zestawu, a nie dla analitu.
Na czwartym miejscu jest definicja analitu, łatwa do przeoczenia. GLP-1 całkowity wobec aktywnego GLP-1, FGF-23 nienaruszony wobec C-końcowego, grelina acylowana wobec deacylowanej, BNP wobec NT-proBNP — to różne pomiary, a zestaw poda dokładnie to, co rozpoznaje jego para przeciwciał. Specyfikację stanowią tu tabele reaktywności krzyżowej w ulotce zestawu, zwłaszcza w przypadku rodzin takich jak produkty proglukagonu, gdzie nakładanie się sekwencji jest znaczne.
Pobieranie próbek jest częścią oznaczenia
Więcej niepowodzeń wynika z pobierania próbek niż z samego zestawu. Kilka peptydów ulega degradacji w ciągu kilku minut od pobrania krwi, jeśli próbka nie jest zabezpieczona: aktywne GLP-1 i GIP wymagają inhibitora DPP-4; acylogrelina wymaga zakwaszenia i zahamowania proteaz; wazopresyna jest na tyle niestabilna, że zamiast niej oznacza się kopeptynę. Wybór antykoagulantu ma znaczenie, ponieważ zestaw zwalidowany na osoczu z EDTA może zachowywać się inaczej w osoczu heparynowym lub surowicy. Zamrażanie i rozmrażanie próbek degraduje wiele analitów, dlatego porcjować należy zarówno odczynniki, jak i próbki. Ulotka zestawu określa wymagany protokół pobierania; traktowanie go jako opcjonalnego unieważnia krzywą wzorcową, za którą zapłacono.
Prawidłowe wykonanie oznaczenia
O powtarzalności decydują głównie cztery praktyki. Wzorce i próbki należy oznaczać w duplikatach, a współczynnik zmienności powyżej około 15% między powtórzeniami traktować jako problem z pipetowaniem lub płukaniem, a nie szum. Przed rozpoczęciem wszystkie odczynniki należy doprowadzić do podanej temperatury — zimne płytki i zimny substrat powodują efekty brzegowe i dryf kinetyki na płytce. Płukanie należy wykonywać dokładnie i jednolicie; niepełne płukanie jest najczęstszą pojedynczą przyczyną wysokiego tła w formatach enzymatycznych. Krzywą wzorcową należy dopasować odpowiednim modelem: testy kompetycyjne mają przebieg sigmoidalny i wymagają czteroparametrycznego dopasowania logistycznego, a nie regresji liniowej przez punkty środkowe. Gdy oczekiwane stężenie celu jest nieznane, przed wykorzystaniem całej płytki należy wykonać serię rozcieńczeń próbki pilotażowej.
Przechowywanie, okres przydatności i materiały do zestawów
Zestawy są wysyłane jako komplety wieloskładnikowe, a ich składniki mają różne wymagania — większość przechowuje się w 2–8 °C, przy czym wzorce, kontrole lub koniugat są często dostarczane w postaci liofilizowanej lub zamrożonej. Należy postępować zgodnie z ulotką dla każdego składnika, zamiast przechowywać całe opakowanie w jednakowych warunkach. Po rekonstytucji stabilność wzorca jest ograniczona, zwykle do kilku dni w 2–8 °C lub jednokrotnego zamrożenia w porcjach; ponownie zamrożony wzorzec to cicha przyczyna krzywej, która przestaje odpowiadać poprzedniemu oznaczeniu. Płytki opłaszczone są wrażliwe na wilgoć, dlatego niewykorzystane paski należy ponownie zamknąć ze środkiem osuszającym. Termin ważności zestawu wyznacza jego najmniej stabilny składnik, zwykle koniugat. Materiały eksploatacyjne nieuwzględnione w zestawie — folie do płytek, bufor płuczący, rozcieńczalnik — znajdują się w sekcji materiałów do zestawów, a multipleksowe formaty oparte na kulkach wykorzystują kulki magnetyczne zamiast płytek opłaszczonych. Nasz przewodnik po ELISA i RIA oraz objaśnienie, w jaki sposób te zestawy oznaczają ilościowo peptydy, omawiają chemię leżącą u ich podstaw.
Miejsce zestawów do oznaczeń wśród innych typów produktów
Zestaw należy zamówić, gdy pytanie dotyczy stężenia w próbce. Przeciwciało należy zamówić, gdy pytanie dotyczy lokalizacji lub identyfikacji na blocie, a wzorzec peptydowy — gdy trzeba zastosować znaną ilość, dodać kontrolę odzysku lub zaabsorbować przeciwciało. Peptydy znakowane dostarczają znaczników stosowanych w formatach kompetycyjnych i przy opracowywaniu własnych testów. Warto zacząć od centrum katalogu lub od tematu takiego jak cukrzyca, układ sercowo-naczyniowy czy choroba Alzheimera, gdzie wybór zestawu dźwiga większość ciężaru analitycznego. Wszystkie zestawy katalogowe to badawcze testy immunologiczne dostarczane wyłącznie do badań in vitro oraz zatwierdzonych badań na zwierzętach — żaden nie jest klinicznie zwalidowanym testem diagnostycznym.
Pytania
Czym różni się test kanapkowy od kompetycyjnego?
Test kanapkowy wychwytuje analit między dwoma przeciwciałami wiążącymi różne epitopy, więc sygnał rośnie wraz ze stężeniem. W teście kompetycyjnym analit z próbki konkuruje ze znakowaną wersją o ograniczoną ilość przeciwciała, więc sygnał maleje wraz ze wzrostem stężenia. Krótkie peptydy nie mogą jednocześnie pomieścić dwóch przeciwciał, dlatego oznacza się je metodą kompetycyjną.
Jak wybrać między ELISA a RIA dla tego samego celu?
Domyślnie należy wybrać ELISA, chyba że czułość wymaga inaczej. RIA może zapewniać lepszą czułość dla niektórych małych peptydów i pozostaje metodą referencyjną w części literatury, ale wymaga zezwolenia na pracę z materiałami promieniotwórczymi, pracy w osłonach, licznika gamma i ścieżki utylizacji odpadów, a znacznik I-125 rozpada się z okresem półtrwania wynoszącym około 60 dni.
Czy można stosować zestaw do rodzaju próbki, dla którego nie był walidowany?
Tylko po samodzielnej walidacji. Na nowej matrycy należy przeprowadzić eksperymenty odzysku dodatku i liniowości rozcieńczeń: odzysk w granicach około 80–120% i równoległy przebieg rozcieńczeń wskazują, że matryca jest akceptowalna. Bez tego interferencja matrycy może przesunąć wyniki kilkukrotnie w dowolnym kierunku bez widocznych oznak na płytce.
Dlaczego moje duplikaty są niespójne?
Zazwyczaj z powodu pipetowania lub płukania, a nie zestawu. Należy sprawdzić osadzenie końcówek i technikę przy małych objętościach, upewnić się, że płuczka płytek podaje równe objętości do każdego dołka, oraz potwierdzić, że odczynniki osiągnęły podaną temperaturę przed użyciem. Współczynnik zmienności powtórzeń powyżej około 15% sygnalizuje problem proceduralny, który należy usunąć przed interpretacją oznaczenia.
Czy do krzywej wzorcowej stosować dopasowanie liniowe?
Nie w przypadku testu kompetycyjnego. Takie krzywe mają przebieg sigmoidalny i wymagają czteroparametrycznego dopasowania logistycznego; regresja liniowa przez zakres środkowy zniekształca wartości na obu krańcach. Większość oprogramowania czytników płytek obsługuje dopasowanie 4PL. Krzywe ELISA kanapkowego również zazwyczaj nie są liniowe w całym swoim zakresie.
Czy te zestawy mogą służyć do diagnozowania?
Nie. Każdy zestaw w katalogu badawczym to badawczy test immunologiczny do badań in vitro i zatwierdzonych badań na zwierzętach. Nie są to klinicznie zwalidowane testy diagnostyczne, a wyniki nie mają znaczenia diagnostycznego.