Peptydy znakowane (fluorescencyjne, biotyna, I-125): czym są i jak je wybierać

Peptydy znakowane to syntetyczne peptydy niosące grupę reporterową — fluorofor, znacznik biotynowy lub radioizotop — dzięki której cząsteczkę można wykryć, śledzić lub wychwycić. Znajdują się w sekcji peptydów znakowanych katalogu badawczego i istnieją z jednego powodu: większość peptydów nie daje własnego sygnału, więc eksperymenty dotyczące wiązania, transportu, wychwytywania i cięcia wymagają znacznika informującego, gdzie znajduje się peptyd lub czy został przecięty. Znacznik jest samodzielnym parametrem specyfikacji, a jego zły wybór marnuje więcej eksperymentów niż wybór niewłaściwej sekwencji.

Trzy rodzaje chemii znakowania i ich zastosowania

Definicje każdego z nich znajdują się w słowniku: znaczniki fluorescencyjne, znacznik biotynowy oraz znacznik radioaktywny I-125.

Gdzie znajduje się znacznik i dlaczego decyduje to o eksperymencie

Pozycja jest równie ważna jak chemia. Znacznik N-końcowy pozostawia wolny C-koniec, co ma znaczenie, gdy do aktywności receptorowej wymagana jest amidacja C-końca — tak jest w przypadku większości neuropeptydów. Znacznik C-końcowy działa odwrotnie. Znakowanie wewnętrzne na łańcuchu bocznym lizyny zachowuje oba końce, ale może znaleźć się w epitopie wiążącym. W przypadku peptydu, którego aktywność zależy od konkretnego końca, należy znakować drugi koniec i potwierdzić testem funkcjonalnym, że wersja znakowana zachowuje aktywność — znakowany ligand, który przestał wiązać, to częste i kosztowne odkrycie dokonywane zbyt późno.

Z tego samego powodu istnieją łączniki (spacery). Kwas aminoheksanowy (Ahx) lub krótkie łączniki PEG utrzymują znacznik z dala od peptydu, zmniejszając zawadę przestrzenną zarówno przy wiązaniu z receptorem, jak i przy wychwytywaniu przez streptawidynę. Biotyna bez łącznika jest często niedostępna, gdy peptyd jest związany z powierzchnią lub dużym partnerem.

Substraty fluorogenne: przypadek szczególny

Testy proteaz wykorzystują odrębną konstrukcję. Peptyd zawiera fluorofor i wygaszacz po obu stronach miejsca cięcia; dopóki jest nienaruszony, transfer energii utrzymuje niski sygnał, a cięcie rozdziela parę, więc fluorescencja rośnie. Tu para znaczników definiuje test: wygaszacz musi pokrywać się z emisją fluoroforu, a długości fali wzbudzenia i emisji muszą odpowiadać zestawowi filtrów czytnika płytek. Zamówienie substratu opartego na Cy5 do aparatu skonfigurowanego dla fluoresceiny nie da żadnych danych. Substraty te dominują w sekcjach katepsyn i proteaz macierzy i pojawiają się w całym temacie nowotworów.

Wybór znacznika do badania wiązania

Klasyczny eksperyment wiązania kompetycyjnego łączy nieznakowany peptyd ze znakowanym znacznikiem. Wybór znacznika zależy od receptora i odczytu. I-125 pozostaje opcją najczulszą i jest praktycznie bezkonkurencyjny w autoradiografii receptorowej na skrawkach tkankowych, dlatego utrzymuje się w farmakologii sercowo-naczyniowej i neuropeptydowej mimo uciążliwości obsługi. Znaczniki fluorescencyjne umożliwiają obrazowanie żywych komórek i polaryzację fluorescencji oraz nie wymagają zezwoleń, ale są mniej czułe, a objętość barwnika może zaburzać wiązanie. Peptydy biotynylowane są wyborem, gdy celem jest wychwytywanie, a nie ilościowe powinowactwo — pull-down, multipleksowe testy na kulkach i detekcja w ELISA, zwykle wraz z kulkami magnetycznymi. Nasz przewodnik po peptydach znakowanych oraz objaśnienie dotyczące FAM, biotyny i I-125 porównują je bardziej szczegółowo.

Parametry do sprawdzenia przed zamówieniem

Poza zwykłymi kontrolami sekwencji, czystości i gatunku, które dotyczą każdego peptydu badawczego, produkty znakowane wymagają sprawdzenia czterech dodatkowych parametrów. Tożsamość i pozycja znacznika — podane wprost, łącznie z tym, która reszta niesie znacznik wewnętrzny. Właściwości spektralne znaczników fluorescencyjnych: maksima wzbudzenia i emisji oraz współczynnik ekstynkcji potrzebny do obliczenia stężenia na podstawie absorbancji. Stopień znakowania, jeśli ma to znaczenie: preparat powinien być znakowany pojedynczo, a mieszanina form mono- i diznakowanych komplikuje oznaczenia ilościowe. Aktywność właściwa w przypadku produktów radioznakowanych, wraz z datą odniesienia — znacznik I-125 ma połowę pierwotnej siły po około 60 dniach od kalibracji, więc do zaplanowania eksperymentu potrzebne są zarówno wartość, jak i data.

Przechowywanie i obsługa

Peptydy znakowane są mniej odporne niż ich nieznakowane odpowiedniki. Należy je zawsze chronić przed światłem — fluorofory ulegają fotowybielaniu w zwykłym oświetleniu laboratoryjnym, dlatego należy stosować fiolki z ciemnego szkła lub folię, a porcjowanie wykonywać przy ograniczonym oświetleniu. Porcjować należy przy pierwszej rekonstytucji; powtarzane zamrażanie i rozmrażanie degraduje zarówno peptyd, jak i barwnik. W przypadku znaczników opartych na fluoresceinie należy pilnować pH, ponieważ ich emisja gwałtownie spada poniżej pH 7 — zmiana buforu może wyglądać jak efekt biologiczny. Peptydy radioznakowane wymagają odpowiedniego zezwolenia, wydzielonego miejsca pracy, osłon i udokumentowanej ścieżki utylizacji odpadów, a rozpad izotopu narzuca sztywne ograniczenia czasowe przy zamawianiu. Ogólne zasady dotyczące samego peptydu pozostają niezmienione: zamknięte w −20 °C lub niżej, doprowadzenie do temperatury pokojowej przed otwarciem, porcje jednorazowe (przewodnik po przechowywaniu, przewodnik po porcjowaniu).

Miejsce peptydów znakowanych wśród innych typów produktów

Nieznakowany wzorzec peptydowy należy zamówić, gdy stosuje się znaną ilość lub tworzy krzywą wzorcową; wersję znakowaną należy dodać, gdy trzeba wykryć sam peptyd. Przeciwciało należy stosować, gdy trzeba wykryć endogenną cząsteczkę w tkance, a zestaw do oznaczeń — gdy pytanie dotyczy stężenia w próbce. Znakowane przeciwciała wykorzystują te same rodzaje chemii znakowania w odniesieniu do immunoglobulin. Warto zacząć od centrum katalogu lub od strony rodziny, takiej jak GLP-1 czy NPY, aby sprawdzić, jakie warianty znakowane są dostępne. Wszystkie produkty katalogowe są dostarczane wyłącznie do badań in vitro oraz zatwierdzonych badań na zwierzętach.