Słownik
Znacznik biotynowy
Biotynylacja daje peptydowi uchwyt o powinowactwie femtomolowym do wychwytu przez streptawidynę. Długość łącznika, endogenna biotyna i ograniczenia elucji.
Znacznik biotynowy to cząsteczka biotyny (witaminy B7) skoniugowana z peptydem, zwykle na N-końcu lub w łańcuchu bocznym lizyny. Jego wartość wynika z oddziaływania ze streptawidyną: stała dysocjacji w zakresie femtomolowym oznacza jedno z najsilniejszych wiązań niekowalencyjnych w biologii, odporne na detergenty, wysokie stężenie soli i umiarkowane czynniki denaturujące.
Zastosowania i ograniczenia
Peptydy biotynylowane to standardowe narzędzie do pull-down i identyfikacji celów na kulkach magnetycznych ze streptawidyną, do immobilizacji na płytkach ELISA i chipach SPR opłaszczonych streptawidyną oraz do wzmocnionej detekcji, w której koniugat streptawidyna-HRP zastępuje znakowane przeciwciało drugorzędowe.
Powtarzają się trzy praktyczne ograniczenia. Po pierwsze, długość łącznika: walerianowy ogon biotyny jest krótki, a kieszeń wiążąca głęboka, dlatego zwykle wprowadza się łącznik z kwasu aminoheksanowego lub PEG, aby peptyd pozostał dostępny. Po drugie, endogenna biotyna: tkanki takie jak wątroba, nerki i mózg zawierają tyle wolnej biotyny, że może ona konkurować, co wymaga etapu blokowania awidyną/biotyną. Po trzecie, elucja: oddziaływanie jest tak silne, że odzyskanie nienaruszonych kompleksów wymaga zwykle gotowania w SDS, długiej inkubacji z nadmiarem wolnej biotyny lub rozszczepialnego łącznika zaprojektowanego od początku.
Powiązane terminy i materiały
znacznik FAM/FITC · znacznik radioaktywny I-125 · czystość. Materiały referencyjne: peptydy znakowane, przeciwciała znakowane. Dalsza lektura: przewodnik po peptydach znakowanych.