Molekül-Leitfäden
Peptidsequenzen richtig lesen: Ein- und Dreibuchstabencodes, Modifikationen, Amidierung
Peptidsequenzen lesen: Richtung von N nach C, Ein- und Dreibuchstabencodes, Ac- und -NH2-Modifikationen sowie die Berechnung des Molekulargewichts.
Eine Peptidsequenz wird vom N-Terminus links zum C-Terminus rechts geschrieben, entweder mit Ein- oder mit Dreibuchstabencodes für die Aminosäuren, wobei jede chemische Modifikation als Präfix oder Suffix an dem Ende notiert wird, auf das sie sich bezieht. Das Lesen einer Peptidsequenz lässt sich in etwa zehn Minuten erlernen, und es ist der mit Abstand schnellste Weg, ein Vial auf Plausibilität gegenüber seinem Analysenzertifikat zu prüfen: Die Sequenz kodiert die Identität, sagt das Molekulargewicht voraus und erklärt das meiste von dem, was ein Molekül in Lösung tut. Dieser Leitfaden behandelt die beiden Codesysteme, die Konventionen zur Richtung, die Kurzschreibweisen für Modifikationen, denen Sie auf Forschungsetiketten tatsächlich begegnen, sowie eine Beispielrechnung, die aus einer Sequenz ein Molekulargewicht ermittelt, das Sie mit einem COA vergleichen können. Alles Folgende beschreibt Referenzmaterial für das Labor.
Richtung: warum N nach C wichtig ist
Aminosäuren verbinden sich über eine Peptidbindung, die zwischen der Carboxylgruppe eines Rests und der Aminogruppe des nächsten gebildet wird. Diese Reaktion ist gerichtet, sodass eine Kette zwei chemisch unterschiedliche Enden hat: eine freie Aminogruppe (den N-Terminus) und eine freie Carboxylgruppe (den C-Terminus). Nach allgemeiner Konvention wird der N-Terminus zuerst geschrieben. Gly-Glu-Pro und Pro-Glu-Gly sind unterschiedliche Moleküle mit identischer Zusammensetzung und identischer Masse, und ein Massenspektrometer allein kann sie nicht unterscheiden, weshalb eine Identitätsbestätigung per MS normalerweise mit einer angegebenen Sequenz kombiniert und nicht an deren Stelle verwendet wird.
Die Nummerierung der Reste folgt derselben Richtung. Lautet ein Etikett HGH Fragment 176-191, beziehen sich die Zahlen auf Positionen, gezählt vom N-Terminus des Ausgangsproteins mit 191 Resten; das Fragment besteht aus den 16 Resten auf diesen Positionen und ist keine separat entworfene Sequenz.
Peptidsequenzen lesen: Ein- und Dreibuchstabencodes
Dreibuchstabencodes sind gut lesbar und eindeutig, weshalb sie auf Produktetiketten und COAs vorherrschen. Einbuchstabencodes sind kompakt und dominieren in Datenbanken, Publikationen und Syntheseauftragsformularen. Beide beschreiben dieselben zwanzig proteinogenen Reste.
Leucin und Isoleucin haben dieselbe Masse, weil sie Strukturisomere sind. Diese eine Tatsache erklärt ein wiederkehrendes Ärgernis in der Peptidanalytik: Die Standard-Massenspektrometrie kann L nicht von I unterscheiden, sodass ihre Zuordnung auf dem Syntheseprotokoll und dem chromatographischen Verhalten beruht und nicht allein auf der Masse.
Ein reales Etikett lesen
BPC-157 ist als Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-Asp-Ala-Gly-Leu-Val katalogisiert, im Einbuchstabencode GEPPPGKPADDAGLV. Fünfzehn Reste, daher „Pentadecapeptid“. Drei aufeinanderfolgende Proline nahe dem N-Terminus verleihen der Kette einen starren Knick, und die beiden benachbarten Aspartate tragen bei neutralem pH eine negative Ladung — beides strukturelle Tatsachen, die Sie direkt an der Sequenz ablesen können, und beide relevant für das Löslichkeitsverhalten.
Kurzschreibweisen für Modifikationen
Die meisten Forschungspeptide sind keine schlichten, unmodifizierten Ketten. Die Notation ist konsistent, sobald man sie kennt.
- Ac- am linken Ende bedeutet N-terminale Acetylierung: Die freie Aminogruppe ist mit einer Acetylgruppe verkappt, was 42.04 Da hinzufügt und eine positive Ladung entfernt. TB-500 wird als Ac-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln geschrieben, d. h. Ac-LKKTETQ.
- -NH2 am rechten Ende bedeutet C-terminale Amidierung: Das terminale -OH wird durch -NH2 ersetzt, was 0.98 Da abzieht und eine negative Ladung entfernt. Viele natürliche Signalpeptide werden in vivo amidiert, und das Amid ist in der Regel für die Rezeptoraktivität erforderlich — Oxytocin wird als Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 geschrieben.
- D- vor einem Rest kennzeichnet das D-Enantiomer, wie das D-Trp in GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2). D-Reste haben dieselbe Masse wie ihre L-Gegenstücke, sind aber schlechte Substrate für Säugetierproteasen und werden daher gezielt eingefügt, um den Abbau zu verlangsamen.
- Nicht-Standard-Reste erscheinen mit ihrem Namen. Aib ist α-Aminoisobuttersäure, ein helixstabilisierender, proteaseresistenter Rest, der in Ipamorelin (Aib-His-D-2-Nal-D-Phe-Lys-NH2) und an Position 2 des GLP-1-Rückgrats in Semaglutide und Tirzepatide verwendet wird. 2-Nal ist 2-Naphthylalanin.
- Eckige Klammern und hochgestellte Zeichen bezeichnen Substitutionen gegenüber einer Ausgangssequenz, z. B. bedeutet [D-Ala²], dass Position 2 gegen D-Alanin ausgetauscht wurde.
- Eine Zyklisierung wird durch eine Linie, eine Klammerung „cyclo(...)“ oder eine angegebene Cys–Cys-Disulfidbrücke dargestellt. Cys1 und Cys6 von Oxytocin bilden eine Disulfidbrücke, die einen Ring aus sechs Resten schließt; diese Bindung ist reduktionsempfindlich und ein echter Faktor bei der Lagerung.
Rechenbeispiel: von der Sequenz zum Molekulargewicht
Das Molekulargewicht ist die Summe der Restmassen plus 18.02 Da für das bei der Kettenbildung freigesetzte Wassermolekül, anschließend korrigiert um Modifikationen. Zwei Beispiele mit katalogisierten Werten:
- KPV (Lys-Pro-Val). 128.17 + 97.12 + 99.13 = 324.42. Plus 18.02 → 342.44 Da. Der Katalog nennt 342.43; die Differenz von 0.01 ist ein Rundungseffekt der Restmassentabelle.
- Epitalon (Ala-Glu-Asp-Gly, AEDG). 71.08 + 129.12 + 115.09 + 57.05 = 372.34. Plus 18.02 → 390.36 Da, gegenüber katalogisierten 390.35.
- Eine Modifikation hinzufügen. Eine acetylierte, amidierte Version desselben Tetrapeptids hätte 390.36 + 42.04 − 0.98 = 431.42 Da.
Eine Übereinstimmung innerhalb von etwa 0.1 % ist das erwartete Ergebnis. Eine Abweichung von 18 Da bedeutet meist, dass der Wasserterm vergessen wurde; 42 Da, dass eine Acetylgruppe übersehen wurde; 1 Da, dass ein Amid nicht berücksichtigt wurde. Sobald Sie ein verlässliches Molekulargewicht haben, können Sie zwischen Masse und Stoffmenge für die Pufferherstellung umrechnen — die Rechnung wird im Beitrag zu Molekulargewicht, Stoffmenge und Molarität sowie im Molaritätsrechner behandelt.
Sequenzen auf einem COA versus Sequenzen im Katalog
Ein Katalogeintrag nennt die vorgesehene Sequenz. Ein COA berichtet, was gemessen wurde: eine beobachtete monoisotopische oder mittlere Masse aus der MS und einen Reinheitswert aus der Reversed-Phase-HPLC. Keine der beiden Techniken liest die Sequenz Rest für Rest, sofern keine MS/MS-Fragmentierungsdaten mitgeliefert werden, was bei routinemäßigen kommerziellen Zertifikaten unüblich ist. Betrachten Sie die angegebene Sequenz als Erklärung des Herstellers und die gemessene Masse als deren Überprüfung.
Häufige Lesefehler
- Von C nach N lesen. Die Umkehrung einer Sequenz ergibt ein anderes Molekül (ein Retro-Peptid) mit derselben Masse. Vergewissern Sie sich stets, dass der äußerst linke Rest der N-Terminus ist.
- Eine Salzform als Teil der Sequenz behandeln. Trifluoracetat- oder Acetat-Gegenionen sind keine Reste; sie tragen zur Masse des Vial-Inhalts bei, nicht aber zu der des Peptids. Dies ist der übliche Grund, warum eine abgewogene Pulvermenge weniger Peptid enthält, als die Etikettmasse nahelegt, und deshalb gehört der TFA-Salzgehalt auf das COA.
- Annehmen, dass die Fragmentnummerierung der Fragmentlänge entspricht. „176-191“ sind 16 Reste, nicht 191.
- Das Amid ignorieren. Eine Sequenz, die nur in ihrer amidierten Form aktiv ist, ist ein anderes Forschungsreagenz als die Version mit freier Säure, obwohl sich beide nur um ein Dalton unterscheiden.
- Blends mit Einzelsequenzen verwechseln. Ein coformuliertes Vial wie der KLOW Blend enthält vier Sequenzen und kein einzelnes Molekulargewicht; siehe Blends vs. Einzel-Vials.
Stimmen eine Sequenz, ein angegebenes Molekulargewicht und eine beobachtete MS-Masse überein, haben Sie einen vernünftigen Beleg dafür, dass das Vial enthält, was auf dem Etikett steht. Weichen sie voneinander ab, ist die Sequenz fast immer der schnellste Ansatzpunkt, um herauszufinden, warum.
Fragen
Welches Ende einer Peptidsequenz wird zuerst geschrieben?
Der N-Terminus — das Ende mit der freien Aminogruppe — wird immer links geschrieben, der C-Terminus rechts. Dies ist eine allgemeingültige Konvention in Katalogen, Analysenzertifikaten und der Literatur. Eine umgekehrte Reihenfolge beschreibt ein anderes Molekül mit derselben Masse, die Richtung ist also kein kosmetisches Detail.
Was bedeutet -NH2 am Ende einer Peptidsequenz?
Es kennzeichnet die C-terminale Amidierung: Das -OH der terminalen Carboxylgruppe wurde durch ein Amid -NH2 ersetzt. Die Änderung zieht etwa 0.98 Da ab und entfernt eine negative Ladung. Viele natürlich sezernierte Signalpeptide werden in vivo amidiert, und die Rezeptoraktivität in publizierten Assays geht häufig verloren, wenn das Amid fehlt; daher werden die Form mit freier Säure und die amidierte Form als unterschiedliche Reagenzien behandelt.
Warum enthalten manche Sequenzen D-Aminosäuren?
D-Enantiomere haben dieselbe Masse wie ihre L-Gegenstücke, sind aber für die meisten Säugetierproteasen schlechte Substrate. Synthesechemiker fügen sie an spaltungsanfälligen Positionen ein, um den enzymatischen Abbau in biologischen Matrices zu verlangsamen. GHRP-6, geschrieben als His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2, enthält zwei davon.
Kann mir ein Massenspektrometer die Sequenz verraten?
Nicht anhand einer einfachen Massenmessung. Ein routinemäßiges MS-Ergebnis bestätigt, dass die Gesamtmasse dem erwarteten Wert entspricht; es kann weder Leucin von Isoleucin noch eine Sequenz von ihrem umgekehrten Gegenstück unterscheiden, da diese jeweils dieselbe Masse haben. Sequenzinformationen auf Ebene einzelner Reste erfordern eine MS/MS-Fragmentierung, die auf kommerziellen Analysenzertifikaten in der Regel nicht enthalten ist.
Wie berechne ich das Molekulargewicht aus einer Sequenz?
Addieren Sie die mittleren Restmassen aller Aminosäuren der Kette, addieren Sie dann 18.02 Da für das bei der Bindungsbildung freigesetzte Wasser und korrigieren Sie anschließend um Modifikationen: +42.04 für ein N-terminales Acetyl, −0.98 für ein C-terminales Amid, −2.02 für jede Disulfidbrücke. Für Epitalon (Ala-Glu-Asp-Gly) ergibt die Summe 71.08 + 129.12 + 115.09 + 57.05 = 372.34, plus 18.02 = 390.36 Da.
Warum weicht mein berechnetes Gewicht leicht vom Katalogwert ab?
Kleine Abweichungen von einigen Hundertstel Dalton entstehen durch Rundung in Restmassentabellen oder durch das Vermischen von mittleren und monoisotopischen Werten. Abweichungen von genau 18, 42 oder 1 Da weisen auf einen vergessenen Wasserterm, eine nicht berücksichtigte Acetylgruppe bzw. ein übersehenes Amid hin. Größere Differenzen bedeuten meist, dass das Gegenionsalz in einem Wert enthalten ist und im anderen nicht.
Haben Blends eine einzelne Sequenz?
Nein. Ein coformuliertes Vial wie eine KLOW- oder Wolverine-Zubereitung enthält mehrere unterschiedliche Sequenzen und damit mehrere Molekulargewichte. Sein Analysenzertifikat sollte jede Komponente separat ausweisen, und Molaritätsberechnungen müssen pro Komponente anhand der für diese Komponente angegebenen Masse im Vial durchgeführt werden.