Przeciwciała poliklonalne i antysurowice: czym są i jak je wybierać

Przeciwciała poliklonalne i antysurowice to odczynniki detekcyjne w badaniach nad peptydami: uzyskiwane w zwierzęciu-gospodarzu przeciw zdefiniowanemu peptydowemu immunogenowi, rozpoznają cel w skrawkach tkankowych, na blotach i w testach immunologicznych. W sekcji przeciwciał w katalogu dominują przeciwciała poliklonalne, a nie monoklonalne, z konkretnego powodu — krótkie peptydy mają niewiele epitopów, a odpowiedź poliklonalna obejmująca kilka z nich wykrywa cel skuteczniej niż pojedynczy klon monoklonalny skierowany przeciw cząsteczce, która może mieć zaledwie dziesięć reszt.

Antysurowica, oczyszczona IgG czy przeciwciało oczyszczane metodą powinowactwa: co faktycznie się kupuje

Hasła słownikowe dotyczące antysurowicy, oczyszczonej IgG oraz przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych szczegółowo przedstawiają te różnice. Wpisy katalogowe określają format każdego produktu; samo określenie „przeciwciało” nie jest wystarczającą specyfikacją.

Immunogen jest specyfikacją

Całe zachowanie przeciwciała przeciw peptydowi wynika z tego, przeciw czemu zostało uzyskane. Sekwencja immunogenu wskazuje, który region cząsteczki macierzystej jest rozpoznawany, a to determinuje trzy rzeczy, które trzeba wiedzieć przed zamówieniem. Czy rozróżnia formy przetworzone? Przeciwciało uzyskane przeciw C-końcowi peptydu nie rozpozna prekursora wydłużonego na C-końcu — co jest dokładnie tym, czego się oczekuje przy pomiarze dojrzałego hormonu, i dokładnie niewłaściwe przy pomiarze puli całkowitej. Czy reaguje krzyżowo w obrębie rodziny? Antysurowice przeciw konserwatywnemu regionowi środkowemu produktów proglukagonu rozpoznają w równym stopniu glukagon, glicentynę i oksyntomodulinę. Czy wymagana jest modyfikacja? Przeciwciała swoiste wobec fosforylacji i amidacji są uzyskiwane przeciw zmodyfikowanym immunogenom i nie powinny rozpoznawać sekwencji niezmodyfikowanej — ta swoistość stanowi całą wartość odczynnika w pracach nad tau i neuropeptydami.

Gatunek gospodarza, reaktywność gatunkowa i dwa aspekty ich znaczenia

To różne parametry specyfikacji i oba mają znaczenie. Gatunek gospodarza — zwykle królik, czasem koza, owca lub świnka morska — określa, które przeciwciało wtórne jest potrzebne i które przeciwciała pierwszorzędowe można multipleksować. Dwóch króliczych przeciwciał pierwszorzędowych nie da się rozróżnić przeciwciałem wtórnym w tym samym skrawku. Reaktywność gatunkowa to informacja, wersję celu z jakich organizmów przeciwciało rozpoznaje; wynika ona z konserwatywności sekwencji, a nie z gatunku gospodarza. Królicze przeciwciało uzyskane przeciw ludzkiemu amyloidowi beta może, ale nie musi rozpoznawać sekwencji gryzoni; wpis katalogowy podaje przetestowaną reaktywność, a nieprzetestowane gatunki należy traktować jako nieznane, a nie zakładać reaktywności. Zob. reaktywność gatunkowa.

Walidacja: kontrole, dzięki którym wynik nadaje się do publikacji

Swoistość przeciwciał jest najczęstszym problemem z powtarzalnością w badaniach nad peptydami, a kontrole są dobrze ugruntowane. Podstawową jest kontrola z peptydem blokującym: przeciwciało inkubuje się wstępnie z nadmiarem peptydu immunogenu, po czym swoiste wybarwienie lub prążek powinny zniknąć, a sygnał nieswoisty pozostać. Dla większości antysurowic katalogowych dostępny jest odpowiadający im peptyd blokujący, a jego użycie stanowi różnicę między obrazem sugestywnym a udokumentowanym. Ponadto: próbka z nokautem lub wyciszeniem genu, jeśli istnieje, kontrola z samym przeciwciałem wtórnym oraz — w przypadku twierdzeń ilościowych — ortogonalne potwierdzenie spektrometrią mas lub niezależne przeciwciało skierowane przeciw innemu epitopowi. W dziedzinach, w których walidacja przeciwciał była publicznie kwestionowana, takich jak iryzyna, kontrole te są bezwzględnie konieczne.

Specyfikacje zastosowań i ich znaczenie

Wpisy katalogowe wymieniają zwalidowane zastosowania wraz z sugerowanymi rozcieńczeniami roboczymi — zwykle immunohistochemię, immunofluorescencję, Western blot, ELISA, RIA i immunoprecypitację. Obowiązują dwie przestrogi. Po pierwsze, przeciwciało zwalidowane w jednym zastosowaniu może zawieść w innym: odczynniki rozpoznające epitopy konformacyjne często działają w immunohistochemii i zawodzą w denaturującym Western blot, a przeciwciała przeciw epitopom liniowym często wykazują odwrotny wzorzec. Po drugie, rozcieńczenia robocze są punktem wyjścia do miareczkowania we własnym układzie, a nie wartościami stałymi — rodzaj próbki, utrwalanie i chemia detekcji przesuwają optimum. W pracach immunoprecypitacyjnych przeciwciało łączy się zazwyczaj z kulkami magnetycznymi, a przeciwciała znakowane zawierają koniugaty do detekcji bezpośredniej.

Przechowywanie i obsługa

Przeciwciała to białka w roztworze i postępuje się z nimi zupełnie inaczej niż z liofilizowanymi peptydami. Należy porcjować je od razu po otrzymaniu — ma to dla przeciwciał większe znaczenie niż dla niemal czegokolwiek innego w katalogu, ponieważ powtarzane zamrażanie i rozmrażanie powoduje agregację IgG i nieodwracalnie obniża miano. Porcje jednorazowe należy przechowywać w −20 °C, a porcję roboczą w krótkotrwałym użyciu w 2–8 °C, pamiętając o konserwancie podanym na fiolce: powszechnie stosowany azydek sodu jest niezgodny z detekcją z użyciem peroksydazy chrzanowej, dlatego przeciwciała zawierające azydek muszą zostać poddane dializie przed koniugacją z HRP. Liofilizowane antysurowice należy rekonstytuować w podanej objętości wody, a następnie niezwłocznie porcjować. Należy unikać zamrażarek z funkcją no-frost, których cykle odszraniania narażają zapasy na powtarzane częściowe rozmrażanie. Ogólne zasady przedstawiono w przewodniku po porcjowaniu i przewodniku po przechowywaniu.

Miejsce przeciwciał wśród innych typów produktów

Przeciwciało należy zamówić, gdy trzeba wykryć lub zlokalizować endogenną cząsteczkę w tkance, komórkach lub lizacie. Odpowiadający mu wzorzec peptydowy należy zamówić jako kontrolę z peptydem blokującym i jako kontrolę pozytywną na blocie. Zestaw ELISA lub RIA należy zamówić, gdy pytanie dotyczy ilości celu w próbce — zestaw zawiera dopasowaną parę przeciwciał, wzorce i zwalidowany zakres, a przy tym jest szybszy i bardziej powtarzalny niż składanie poszczególnych elementów. Warto zacząć od centrum katalogu lub od tematu takiego jak choroba Alzheimera, nowotwory czy cukrzyca, gdzie wybór przeciwciała dźwiga większość ciężaru eksperymentalnego. Wszystkie produkty katalogowe są dostarczane wyłącznie do badań in vitro oraz zatwierdzonych badań na zwierzętach i żaden nie jest odczynnikiem diagnostycznym.