Czym jest VIP (wazoaktywny peptyd jelitowy)? Struktura, mechanizm i badania

VIP — wazoaktywny peptyd jelitowy (vasoactive intestinal peptide) — to 28-resztowy neuropeptyd amidowany na C-końcu, należący do nadrodziny sekretyny i glukagonu, który sygnalizuje przez receptory sprzężone z białkiem G VPAC1 i VPAC2, podnosząc wewnątrzkomórkowe stężenie cyklicznego AMP. Po raz pierwszy wyizolowany z jelita świni na początku lat 70. ze względu na aktywność rozszerzającą naczynia, okazał się rozmieszczony daleko poza przewodem pokarmowym: w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym, drogach oddechowych, przewodzie pokarmowym i tkance immunologicznej. Ta rozległość sprawia, że jedna cząsteczka pojawia się w tak różnych dziedzinach literatury jak biologia rytmów dobowych, fizjologia dróg oddechowych i regulacja immunologiczna.

Niniejsza strona omawia pochodzenie i strukturę VIP, jego farmakologię receptorową, obszary badań, w których jest stosowany, oraz praktyczne szczegóły laboratoryjne — wielkości, obliczenia rekonstytucji, stabilność i interpretację certyfikatu. VIP jest dostarczany w postaci liofilizowanego proszku.

Pochodzenie i struktura

VIP został wyizolowany przez Saida i Mutta z dwunastnicy świni podczas systematycznych poszukiwań jelitowych substancji wazoaktywnych, a jego nazwa odzwierciedla tę historię, a nie jego biologię — cząsteczka nie jest przede wszystkim hormonem jelitowym. Jest kodowana przez gen VIP, którego prekursor daje również pokrewny peptyd PHM (u niektórych gatunków PHI), i jest syntetyzowana w neuronach, a nie w klasycznym gruczole dokrewnym, pełniąc funkcję neuroprzekaźnika i mediatora parakrynnego.

Definiują go dwie cechy strukturalne. Pierwsza to przynależność do rodziny: VIP wykazuje znaczną identyczność sekwencji z PACAP, sekretyną, glukagonem i hormonem uwalniającym hormon wzrostu, które przyjmują porównywalne helikalne zwinięcie i oddziałują z receptorami sprzężonymi z białkiem G klasy B za pomocą mechanizmu dwudomenowego — C-końcowa połowa peptydu wiąże dużą domenę zewnątrzkomórkową receptora, a reszty N-końcowe następnie oddziałują z rdzeniem transbłonowym, uruchamiając sygnalizację. Ten podział ma bezpośrednią konsekwencję eksperymentalną: fragmenty skrócone na N-końcu zachowują wiązanie, ale tracą zdolność aktywacji — w ten sposób konstruuje się antagonistów w tej rodzinie.

Druga cecha to amidacja C-końca. Natywny peptyd kończy się amidem asparaginy zamiast wolnej grupy karboksylanowej — modyfikacją potranslacyjną wytwarzaną przez monooksygenazę peptydyloglicyno-alfa-amidującą. Amidacja usuwa końcowy ładunek ujemny i jest wymagana do pełnego oddziaływania z receptorem; wersja tej samej sekwencji z wolnym kwasem jest istotnie inną cząsteczką. Każde laboratorium zamawiające VIP powinno potwierdzić obecność amidu, ponieważ jest to rzeczywiste i istotne w skutkach rozróżnienie między produktami.

Jak prawdopodobnie działa VIP

VIP wiąże VPAC1 i VPAC2 z mniej więcej porównywalnym powinowactwem, a oba receptory sprzęgają się głównie z Gs. Obsadzenie receptora aktywuje cyklazę adenylanową, podnosi poziom cyklicznego AMP i aktywuje kinazę białkową A, z dalszymi zmianami transkrypcyjnymi zależnymi od CREB. W niektórych układach opisywano dodatkowe sprzężenie z fosfolipazą C, a oba receptory wykazują również rekrutację beta-arestyny i internalizację.

Ponieważ VPAC1 i VPAC2 mają różne rozmieszczenie tkankowe — VPAC1 wyraźniej w płucach, wątrobie i limfocytach, VPAC2 m.in. w mięśniach gładkich, jądrze nadskrzyżowaniowym i wyspach trzustkowych — ten sam ligand daje bardzo różne odczyty na poziomie tkanek. Z tego powodu wiele badań nad VIP wykorzystuje selektywne analogi zamiast natywnego peptydu: aby przypisać efekt jednemu podtypowi receptora, a nie obu.

Trzy konsekwencje wzrostu cyklicznego AMP wyjaśniają większość opisywanej fizjologii. W mięśniach gładkich aktywność kinazy białkowej A zmniejsza napięcie skurczowe, co jest podstawą rozszerzenia naczyń i rozkurczu dróg oddechowych obserwowanych w pierwotnych badaniach. W komórkach odpornościowych podwyższony cykliczny AMP jest w literaturze ogólnie wiązany ze zmniejszoną produkcją cytokin prozapalnych i zmianami fenotypu limfocytów T. W neuronach jądra nadskrzyżowaniowego sygnalizacja VPAC2 ma według doniesień kluczowe znaczenie dla synchronizacji dobowego rozrusznika — myszy pozbawione VPAC2 wykazują wyraźnie zaburzoną rytmikę dobową.

W praktyce ogromne znaczenie ma jedna właściwość: natywny VIP jest krótkotrwały. Jest substratem dla dipeptydylopeptydazy-4 i innych peptydaz, a jego okres półtrwania w osoczu opisuje się w minutach. Istnieje bardzo obszerna literatura stosowana dotycząca wyłącznie stabilizowanych analogów i systemów dostarczania, a każdy eksperyment z natywną sekwencją w układzie zawierającym aktywne proteazy musi to uwzględniać.

Co badano dotychczas

Modulacja immunologiczna i stan zapalny

VIP pojawia się szeroko w pracach dotyczących fenotypu makrofagów i komórek dendrytycznych, indukcji limfocytów T regulatorowych i profili cytokin oraz w modelach chorób autoimmunologicznych i zapalnych u gryzoni. Ten nurt stawia go obok KPV i LL-37 w katalogach ukierunkowanych na stan zapalny, choć mechanizmy są niepowiązane: odpowiednio agonista GPCR klasy B, wewnątrzkomórkowy modulator NF-kappa B i aktywny błonowo peptyd obrony gospodarza.

Fizjologia przewodu pokarmowego

Jako główny przekaźnik jelitowych hamujących neuronów ruchowych VIP jest badany w kontekście rozkurczu mięśni gładkich, zachowania zwieraczy, wydzielania i biologii bariery. Badacze zajmujący się barierą nabłonkową często łączą go z octanem larazotydu, który działa bezpośrednio na połączenia ścisłe, a nie poprzez sygnalizację receptorową.

Badania dróg oddechowych i płuc

Rozszerzenie oskrzeli, napięcie naczyń płucnych i modele nadciśnienia płucnego tworzą odrębny zbiór prac, częściowo obejmujący badania kliniczne analogów VIP, a nie natywnego peptydu.

Badania rytmów dobowych i neuronauka

Neurony jądra nadskrzyżowaniowego z ekspresją VIP są ważnym tematem chronobiologii, a sygnalizacja VPAC2 jest wiązana ze sprzężeniem między komórkami rozrusznika. Niezależnie od tego VIP pojawia się w badaniach neuroprotekcji i rozwoju układu nerwowego.

Farmakologia receptorowa

Natywny VIP jest rutynowo stosowany jako agonista referencyjny w testach wiązania VPAC1 i VPAC2 oraz akumulacji cyklicznego AMP — to prawdopodobnie jego najczęstsza rola laboratoryjna, całkowicie zależna od tego, czy materiał jest prawidłowo amidowany i ma zweryfikowaną czystość.

Wszystkie powyższe prace mają charakter przedkliniczny i in vitro. Natywny VIP nie ma pozwolenia na dopuszczenie do obrotu, a badania kliniczne w tej dziedzinie dotyczyły analogów i formulacji, a nie peptydu klasy badawczej.

Dostępne formy i wielkości

VIP jest dostępny w postaci liofilizowanego proszku w zamkniętych fiolkach 5 mg (115 €) i 10 mg (200 €). Przy 3326.80 g/mol fiolka 5 mg zawiera około 1.5 mikromola. Ponieważ testy receptorowe zwykle działają w zakresie nanomolowym, taka ilość wystarcza na bardzo wiele doświadczeń farmakologicznych; prace formulacyjne i na zwierzętach zużywają ją znacznie szybciej. Materiały pokrewne zgrupowano w kategorii peptydów przeciwzapalnych, a kontrole przy zakupie opisano w naszym przewodniku zakupowym dla VIP.

Rekonstytucja i przechowywanie w warunkach laboratoryjnych

Obliczenia: fiolka 5 mg po rekonstytucji 1 mL rozcieńczalnika daje 5 mg/mL, czyli 5,000 mcg/mL, co odpowiada około 1.50 mM. Rozcieńczenie tego roztworu podstawowego 1:1,000 daje 1.5 mikromola na litr, a kolejne 1:100 — 15 nanomoli na litr: właśnie takiego rozcieńczenia seryjnego wymaga test wiązania VPAC. Jawne obliczenie molowości zamiast rozumowania w mikrogramach pozwala uniknąć najczęstszego błędu obliczeniowego w pracy receptorowej.

VIP jest umiarkowanie hydrofobowy w części centralnej i wymaga delikatnego postępowania: rozcieńczalnik należy dodawać powoli po ściance fiolki, obracać fiolkę ruchem kolistym zamiast nią wstrząsać i pozwolić liofilizatowi rozpuścić się bez worteksowania. Adsorpcja na naczyniach z tworzyw sztucznych jest istotna przy niskich stężeniach, dlatego standardem są probówki o niskim wiązaniu oraz, w stosownych przypadkach, białko nośnikowe w buforze testowym. Metionina w pozycji 17 jest resztą wrażliwą na utlenianie, co stanowi praktyczny argument za ochroną roztworów podstawowych przed powietrzem i światłem. Liofilizowane fiolki przechowuje się w temperaturze −20 °C lub niższej, chroniąc przed wilgocią; materiał po rekonstytucji dzieli się na porcje i przechowuje w lodówce lub zamrażarce, aby uniknąć wielokrotnego ogrzewania. Pełne wskazówki zawiera przewodnik po przechowywaniu peptydów.

Czystość, COA i sposób odczytu

Każda partia jest oczyszczana metodą HPLC w odwróconym układzie faz do czystości co najmniej 99%, z potwierdzeniem masy i certyfikatem przypisanym do partii. Dwie kontrole są specyficzne dla tego peptydu. Po pierwsze, należy zweryfikować amid: zmierzona masa powinna odpowiadać 3326.80 g/mol dla peptydu amidowanego, a wartość wyższa o około 1 Da wskazuje na wolny kwas. To najważniejsza pojedyncza kontrola tożsamości VIP, odczytywana bezpośrednio z widma masowego. Po drugie, należy szukać śladów utlenienia. Peptyd zawierający metioninę może wykazywać w widmie masowym sygnał satelitarny +16 Da, a na chromatogramie wcześnie eluujące „ramię” — oba są oznakami degradacji oksydacyjnej podczas syntezy lub przechowywania. Poza tym obowiązuje standardowa praktyka — należy czytać chromatogram, a nie samą podaną wartość, oraz porównać zawartość czystego peptydu (net peptide content) z masą brutto w fiolce. Nasz przewodnik po odczytywaniu COA omawia oba zagadnienia szczegółowo.

Status regulacyjny

VIP jest endogennym peptydem człowieka, ale dostarczany tu materiał syntetyczny nie jest zatwierdzonym lekiem, suplementem diety ani ogólnodostępnym preparatem recepturowym. Opublikowane wyniki fizjologiczne opisują peptyd endogenny i badane analogi; nie stanowią twierdzeń dotyczących materiału klasy badawczej.

Pokrewne peptydy i dalsza lektura

Z nadrodziny sekretyny i glukagonu katalog ten obejmuje również analogi GHRH, takie jak sermorelin i tesamorelin, które mają to samo zwinięcie strukturalne i mechanizm receptora klasy B, ale działają na zupełnie inny receptor. Kontekst dotyczący przewodu pokarmowego zawiera przegląd badań nad zdrowiem jelit; oferty instytucjonalne grupują materiały pokrewne na stronie rodziny VIP.