Guias de moléculas
Kits ELISA, EIA e RIA: o que são e como escolher
Como escolher um kit de ensaio de péptidos: ELISA versus EIA versus RIA, sandwich versus competitivo, gama do padrão, matriz da amostra, espécie e regras de colheita.
Os kits ELISA, EIA e RIA respondem a uma questão: que quantidade de um determinado péptido está presente numa amostra. Cada kit da secção de kits de ensaio reúne um anticorpo correspondente, um padrão calibrado, um sistema de deteção e uma gama de concentrações validada num único procedimento validado — razão pela qual comprar um kit é quase sempre mais rápido e mais reprodutível do que reunir por conta própria anticorpo, traçador e padrões. São as especificações do kit, e não a sua marca, que determinam se funcionará nas suas amostras.
ELISA, EIA e RIA: os três formatos comparados
Definições do glossário: ELISA e RIA. A escolha do formato é determinada sobretudo pelo tamanho do péptido. Um ensaio sandwich necessita de dois anticorpos que se liguem simultaneamente a epítopos não sobrepostos, algo que um péptido de dez resíduos não comporta — pelo que os péptidos curtos são medidos por competição, e os ensaios competitivos têm uma curva-padrão inversa, em que um sinal elevado significa pouco analito.
As especificações que decidem se um kit serve
A gama do padrão e a sensibilidade vêm em primeiro lugar. Deve comparar-se a gama do kit com as concentrações esperadas antes de mais: um kit de plasma calibrado na gama dos picogramas saturará com sobrenadante concentrado de cultura celular, e um kit de gama ampla pode não resolver diferenças no extremo inferior de uma medição em plasma de roedor. A sensibilidade, habitualmente indicada como concentração mínima detetável, define o limite inferior.
O tipo de amostra vem em segundo. Os kits são validados em matrizes específicas — soro, plasma com EDTA ou heparina, urina, LCR, extrato de tecido, sobrenadante de cultura celular — e os efeitos de matriz são reais: os componentes do soro podem interferir com a ligação dos anticorpos de formas que os padrões em tampão não reproduzem. Utilizar uma matriz validada, ou realizar uma verificação de recuperação por adição e de linearidade da diluição numa matriz não validada, é a diferença entre números e artefactos.
A espécie vem em terceiro, e é a causa mais frequente de dados inutilizáveis no trabalho metabólico. Um kit de insulina ou de leptina calibrado para humano indica sistematicamente valores incorretos em amostras de roedor. Deve verificar-se a reatividade por espécie no kit, e não no analito.
A definição do analito vem em quarto e passa facilmente despercebida. GLP-1 total versus ativo, FGF-23 intacto versus C-terminal, grelina acilada versus des-acilada, BNP versus NT-proBNP — são medições diferentes, e o kit indicará exatamente aquilo que o seu par de anticorpos reconhece. As tabelas de reatividade cruzada do folheto do kit são aqui a especificação, sobretudo em famílias como os produtos do proglucagon, em que a sobreposição de sequências é extensa.
A colheita da amostra faz parte do ensaio
São mais as falhas de kits que se devem à colheita do que ao próprio kit. Vários péptidos degradam-se poucos minutos após a colheita de sangue, a menos que a amostra seja protegida: o GLP-1 e o GIP ativos requerem um inibidor da DPP-4; a grelina acilada requer acidificação e inibição de proteases; a vasopressina é suficientemente instável para que se meça a copeptina em seu lugar. A escolha do anticoagulante importa, porque um kit validado em plasma com EDTA pode comportar-se de outra forma em heparina ou em soro. A congelação-descongelação das amostras degrada muitos analitos, pelo que se devem aliquotar tanto as amostras como os reagentes. O folheto do kit indica o protocolo de colheita exigido; tratá-lo como opcional invalida a curva-padrão que se pagou.
Executar bem o ensaio
Quatro práticas asseguram a maior parte da reprodutibilidade. Executar padrões e amostras em duplicado e tratar um coeficiente de variação superior a cerca de 15% entre réplicas como um problema de pipetagem ou de lavagem, e não como ruído. Levar todos os reagentes à temperatura indicada antes de começar — placas e substrato frios produzem efeitos de bordo e cinéticas com deriva ao longo da placa. Lavar de forma completa e consistente; a lavagem incompleta é a causa isolada mais comum de fundo elevado nos formatos enzimáticos. E ajustar adequadamente a curva-padrão: os ensaios competitivos são sigmoidais e necessitam de um ajuste logístico de quatro parâmetros, e não de uma regressão linear pelos pontos intermédios. Quando a concentração esperada de um alvo for desconhecida, deve executar-se uma série de diluições numa amostra-piloto antes de comprometer a placa.
Armazenamento, prazo de validade e consumíveis dos kits
Os kits são enviados como conjuntos de vários componentes, e os seus componentes têm requisitos diferentes — a maioria é armazenada a 2–8 °C, sendo os padrões, os controlos ou o conjugado frequentemente fornecidos liofilizados ou congelados. Deve seguir-se o folheto por componente, em vez de armazenar a caixa de forma uniforme. Uma vez reconstituído, o padrão tem estabilidade limitada, habitualmente a alguns dias a 2–8 °C ou a uma única congelação em alíquotas; um padrão recongelado é a causa silenciosa de uma curva que já não corresponde à execução anterior. As placas revestidas são sensíveis à humidade, pelo que as tiras não utilizadas devem ser novamente seladas com exsicante. O prazo de validade do kit é definido pelo componente menos estável, tipicamente o conjugado. Os consumíveis não incluídos — seladores de placa, tampão de lavagem, diluente — encontram-se em consumíveis para kits, e os formatos multiplex baseados em esferas utilizam esferas magnéticas em vez de placas revestidas. O nosso guia de ELISA e RIA e o artigo explicativo sobre como estes kits quantificam péptidos abordam a química subjacente.
Onde se enquadram os kits de ensaio face aos outros tipos de produto
Deve encomendar-se um kit quando a questão for a concentração numa amostra. Encomenda-se um anticorpo quando a questão for a localização ou a identidade num blot, e um padrão peptídico quando for necessário aplicar uma quantidade conhecida, adicionar um controlo de recuperação ou absorver um anticorpo. Os péptidos marcados fornecem os traçadores utilizados nos formatos competitivos e no desenvolvimento de ensaios personalizados. Comece pelo portal do catálogo ou por um tema como a diabetes, o cardiovascular ou o Alzheimer, em que a escolha do kit suporta a maior parte do peso analítico. Todos os kits do catálogo são imunoensaios de investigação fornecidos exclusivamente para investigação in vitro e em animais devidamente aprovada — nenhum é um meio de diagnóstico clinicamente validado.
Perguntas
Qual é a diferença entre um ensaio sandwich e um ensaio competitivo?
Um ensaio sandwich captura o analito entre dois anticorpos que se ligam a epítopos diferentes, pelo que o sinal aumenta com a concentração. Num ensaio competitivo, o analito da amostra compete com uma versão marcada por uma quantidade limitada de anticorpo, pelo que o sinal diminui à medida que a concentração aumenta. Os péptidos curtos não comportam dois anticorpos em simultâneo, razão pela qual são medidos por competição.
Como escolho entre um ELISA e um RIA para o mesmo alvo?
Optar por ELISA, a menos que a sensibilidade exija o contrário. O RIA pode oferecer melhor sensibilidade para alguns péptidos pequenos e continua a ser o método de referência em partes da literatura, mas exige licença para materiais radioativos, manuseamento com blindagem, um contador gama e uma via de eliminação de resíduos, e o traçador de I-125 decai com uma semivida de cerca de 60 dias.
Posso utilizar um kit num tipo de amostra para o qual não foi validado?
Apenas após validação própria. Devem realizar-se experiências de recuperação por adição e de linearidade da diluição na nova matriz: uma recuperação próxima de 80–120% e um comportamento de diluição paralelo indicam que a matriz é aceitável. Sem isso, a interferência da matriz pode alterar os resultados várias vezes, em qualquer sentido, sem sinal visível na placa.
Porque são os meus duplicados inconsistentes?
Normalmente por pipetagem ou lavagem, e não pelo kit. Deve verificar-se o encaixe das pontas e a técnica em volumes pequenos, garantir que o lavador de placas distribui volumes uniformes por todos os poços e confirmar que os reagentes atingiram a temperatura indicada antes da utilização. Um coeficiente de variação entre réplicas superior a cerca de 15% assinala um problema processual que deve ser corrigido antes de interpretar a execução.
Devo utilizar um ajuste linear para a curva-padrão?
Não, não num ensaio competitivo. Estas curvas são sigmoidais e exigem um ajuste logístico de quatro parâmetros; uma regressão linear pela gama média distorce os valores em ambos os extremos. A maioria do software dos leitores de placas inclui o ajuste 4PL. As curvas de ELISA sandwich também são geralmente não lineares em toda a sua gama.
Estes kits podem ser utilizados para diagnosticar alguma coisa?
Não. Todos os kits do catálogo de investigação são imunoensaios de investigação para utilização in vitro e em animais devidamente aprovada. Não são meios de diagnóstico clinicamente validados, e os resultados não têm qualquer significado de diagnóstico.