Guias de moléculas
Anticorpos policlonais e antissoros: o que são e como escolher
Como escolher um anticorpo peptídico: antissoro versus IgG purificada versus purificada por afinidade, imunogénio e epítopo, reatividade por espécie, controlos de bloqueio, armazenamento.
Os anticorpos policlonais e os antissoros são os reagentes de deteção da investigação em péptidos: produzidos num animal hospedeiro contra um imunogénio peptídico definido, reconhecem o alvo em cortes de tecido, em blots e em imunoensaios. A secção de anticorpos do catálogo é dominada por policlonais e não por monoclonais por uma razão específica — os péptidos curtos têm poucos epítopos, e uma resposta policlonal que abranja vários deles deteta o alvo de forma mais robusta do que um único clone monoclonal contra uma molécula que pode ter apenas dez resíduos.
Antissoro, IgG purificada ou purificada por afinidade: o que se está efetivamente a comprar
As entradas do glossário sobre antissoro, IgG purificada e policlonal versus monoclonal expõem as distinções em maior pormenor. As entradas do catálogo indicam o formato de cada artigo; a palavra «anticorpo», por si só, não é uma especificação suficiente.
O imunogénio é a especificação
Todo o comportamento de um anticorpo peptídico decorre daquilo contra o qual foi produzido. A sequência do imunogénio indica que região da molécula de origem é reconhecida, o que determina três aspetos que é necessário conhecer antes de encomendar. Distingue formas processadas? Um anticorpo produzido contra o C-terminal de um péptido não reconhecerá um precursor com extensão C-terminal — o que é exatamente o que se pretende ao medir a hormona madura, e exatamente errado ao medir o total. Tem reatividade cruzada dentro da família? Os antissoros contra a região média conservada dos produtos do proglucagon reconhecem indistintamente o glucagon, a glicentina e a oxintomodulina. É necessária uma modificação? Os anticorpos específicos para fosforilação e para amidação são produzidos contra imunogénios modificados e não devem reconhecer a sequência não modificada — essa especificidade é todo o valor do reagente no trabalho com tau e com neuropéptidos.
Espécie hospedeira, reatividade por espécie e as duas formas como importam
São especificações diferentes e ambas importam. A espécie hospedeira — habitualmente coelho, por vezes cabra, ovelha ou cobaia — determina de que anticorpo secundário se necessita e que primários podem ser combinados em multiplex. Dois primários de coelho não podem ser distinguidos pelo secundário no mesmo corte. A reatividade por espécie é o conjunto de organismos cuja versão do alvo o anticorpo reconhece, e decorre da conservação da sequência, e não do hospedeiro. Um anticorpo de coelho produzido contra a beta-amiloide humana pode ou não reconhecer a sequência de roedor; a entrada do catálogo indica a reatividade testada, e as espécies não testadas devem ser tratadas como desconhecidas e não presumidas. Ver reatividade por espécie.
Validação: os controlos que tornam um resultado publicável
A especificidade dos anticorpos é o problema de reprodutibilidade mais comum na investigação em péptidos, e os controlos estão bem estabelecidos. O controlo com péptido de bloqueio é o principal: pré-incubar o anticorpo com um excesso de péptido imunogénio, e a marcação ou a banda específicas devem desaparecer, enquanto o sinal inespecífico persiste. A maioria dos antissoros do catálogo tem um péptido de bloqueio correspondente disponível, e utilizá-lo é a diferença entre uma imagem sugestiva e uma imagem fundamentada. Além disso: uma amostra com knockout ou knockdown, quando exista, um controlo apenas com o secundário e — para alegações quantitativas — confirmação ortogonal por espectrometria de massa ou com um anticorpo independente contra um epítopo diferente. Os campos em que a validação dos anticorpos foi publicamente contestada, como a irisina, são exatamente aqueles em que estes controlos não são negociáveis.
Especificações de aplicação e o seu significado
As entradas do catálogo listam as aplicações validadas com diluições de trabalho sugeridas — tipicamente imuno-histoquímica, imunofluorescência, Western blot, ELISA, RIA e imunoprecipitação. Aplicam-se duas cautelas. Primeira, um anticorpo validado para uma aplicação pode falhar noutra: os reagentes que reconhecem epítopos conformacionais funcionam frequentemente em imuno-histoquímica e falham num Western desnaturante, enquanto os anticorpos de epítopo linear apresentam muitas vezes o padrão oposto. Segunda, as diluições de trabalho são pontos de partida a titular no sistema de cada laboratório, e não valores fixos — o tipo de amostra, a fixação e a química de deteção deslocam todos o valor ótimo. O trabalho de imunoprecipitação associa geralmente o anticorpo a esferas magnéticas, e os anticorpos marcados incluem os conjugados utilizados na deteção direta.
Armazenamento e manuseamento
Os anticorpos são proteínas em solução e são manuseados de forma bastante diferente dos péptidos liofilizados. Deve aliquotar-se à chegada — isto importa mais para os anticorpos do que para quase tudo o resto do catálogo, porque os ciclos repetidos de congelação-descongelação agregam a IgG e reduzem irreversivelmente o título. Armazenar alíquotas de utilização única a −20 °C, ou a 2–8 °C para uma alíquota de trabalho em utilização a curto prazo, e ter presente o conservante indicado no frasco: a azida de sódio é comum e é incompatível com a deteção por peroxidase de rábano, pelo que os anticorpos com azida têm de ser dialisados antes da conjugação com HRP. Os antissoros liofilizados devem ser reconstituídos no volume de água indicado e aliquotados de imediato. Devem evitar-se os congeladores sem gelo (frost-free), cujos ciclos de descongelação sujeitam as soluções-mãe a descongelações parciais repetidas. Os princípios gerais encontram-se no guia de aliquotagem e no guia de armazenamento.
Onde se enquadram os anticorpos face aos outros tipos de produto
Deve encomendar-se um anticorpo quando for necessário detetar ou localizar a molécula endógena em tecido, células ou lisado. Encomenda-se o padrão peptídico correspondente como controlo de péptido de bloqueio e como controlo positivo num blot. Encomenda-se um kit ELISA ou RIA quando a questão for a quantidade de alvo presente numa amostra — o kit reúne um par de anticorpos correspondente, padrões e uma gama validada, e é mais rápido e mais reprodutível do que reunir as partes. Comece pelo portal do catálogo ou por um tema como Alzheimer, oncologia ou diabetes, em que a escolha do anticorpo suporta a maior parte do peso experimental. Todos os artigos do catálogo são fornecidos exclusivamente para investigação in vitro e em animais devidamente aprovada, e nenhum é um reagente de diagnóstico.
Perguntas
Porque são os anticorpos peptídicos habitualmente policlonais e não monoclonais?
Porque os péptidos curtos apresentam poucos epítopos. Uma resposta policlonal abrange vários deles, proporcionando uma deteção mais robusta quando um epítopo está mascarado pela fixação, pela desnaturação ou por um parceiro de ligação. Os monoclonais oferecem consistência entre lotes e precisão de epítopo único, o que importa no trabalho específico para fosforilação, mas, para a maioria dos péptidos pequenos, um policlonal bem purificado deteta de forma mais fiável.
Devo comprar antissoro integral ou anticorpo purificado por afinidade?
Antissoro para RIA e EIA, em que o fundo é tolerável e o custo por ensaio importa. Purificado por afinidade para imuno-histoquímica, imunofluorescência e Western blots de baixa abundância, em que a imunoglobulina sérica inespecífica produz um fundo que nenhum bloqueio elimina. A IgG purificada por proteína A/G situa-se entre as duas e é sobretudo útil quando é necessária uma concentração definida de IgG.
Como confirmo que um anticorpo é específico?
Executando o controlo com péptido de bloqueio: pré-incubar com um excesso de péptido imunogénio e confirmar que o sinal específico desaparece enquanto o fundo persiste. Acrescentar um controlo apenas com o secundário e uma amostra com knockout ou knockdown, quando disponível. Para alegações quantitativas, confirmar com um segundo anticorpo contra um epítopo diferente ou por espectrometria de massa. Os controlos devem ser citados nos métodos.
Posso utilizar um anticorpo tanto em imuno-histoquímica como em Western blot?
Apenas se ambas estiverem validadas. Os anticorpos que reconhecem epítopos conformacionais funcionam frequentemente em tecido fixado e falham após desnaturação por SDS; os anticorpos de epítopo linear apresentam com frequência o inverso. A entrada do catálogo lista as aplicações testadas — uma aplicação não listada é não testada, e não apenas desaconselhada, e deve primeiro ser validada no sistema de cada laboratório.
Porque perde o meu anticorpo atividade ao longo do tempo?
Quase sempre por congelação-descongelação. Cada ciclo agrega uma fração da IgG, e a perda é cumulativa e irreversível. Deve aliquotar-se em volumes de utilização única à chegada e nunca voltar a congelar uma alíquota de trabalho. Os congeladores sem gelo agravam o problema através dos seus ciclos de descongelação. O armazenamento a 2–8 °C com o conservante indicado é adequado para uma alíquota em utilização ativa.
O que afeta a azida de sódio presente no frasco?
Conserva o anticorpo, mas inibe a peroxidase de rábano, pelo que um anticorpo com azida não pode ser conjugado com HRP nem utilizado em alguns formatos de deteção direta sem diálise prévia. É também tóxica e requer eliminação adequada. Existem formatos sem azida para trabalho de conjugação — deve verificar-se a composição do tampão na entrada do catálogo.