Guías de moléculas
Kits ELISA, EIA y RIA: qué son y cómo elegirlos
Cómo elegir un kit de ensayo peptídico: ELISA frente a EIA frente a RIA, sándwich o competitivo, intervalo de estándares, matriz, especie y reglas de recogida.
Los kits ELISA, EIA y RIA responden a una sola pregunta: cuánto de un péptido determinado hay en una muestra. Cada kit de la sección de kits de ensayo reúne un anticuerpo emparejado, un patrón calibrado, un sistema de detección y un intervalo de concentración validado en un único procedimiento validado, razón por la cual comprar un kit es casi siempre más rápido y reproducible que ensamblar usted mismo anticuerpo, trazador y patrones. Son las especificaciones del kit, y no su marca, las que determinan si funcionará con sus muestras.
ELISA, EIA y RIA: comparación de los tres formatos
Definiciones del glosario: ELISA y RIA. La elección del formato depende sobre todo del tamaño del péptido. Un ensayo tipo sándwich necesita dos anticuerpos que se unan simultáneamente a epítopos no solapados, algo que un péptido de diez residuos no puede acomodar; por eso los péptidos cortos se miden de forma competitiva, y los ensayos competitivos tienen una curva patrón inversa en la que una señal alta significa poco analito.
Las especificaciones que deciden si un kit es adecuado
El intervalo de los patrones y la sensibilidad van primero. Compare el intervalo del kit con las concentraciones esperadas antes que cualquier otra cosa: un kit para plasma calibrado en el intervalo de los picogramos se saturará con un sobrenadante de cultivo celular concentrado, y un kit de intervalo amplio puede no resolver las diferencias en el extremo bajo de una medición en plasma de roedor. La sensibilidad, expresada normalmente como la concentración mínima detectable, fija el límite inferior.
El tipo de muestra es lo segundo. Los kits se validan en matrices concretas —suero, plasma con EDTA o heparina, orina, LCR, extracto tisular, sobrenadante de cultivo celular—, y los efectos matriz son reales: los componentes del suero pueden interferir en la unión de los anticuerpos de formas que los patrones en tampón no reproducen. Utilizar una matriz validada, o realizar una comprobación de recuperación de adición y de linealidad de la dilución en una no validada, marca la diferencia entre obtener cifras y obtener artefactos.
La especie es lo tercero, y la causa más frecuente de datos inutilizables en el trabajo metabólico. Un kit de insulina o leptina calibrado con material humano informa sistemáticamente de forma errónea de las muestras de roedor. Compruebe la reactividad de especie en el kit, no en el analito.
La definición del analito es lo cuarto y pasa fácilmente desapercibida. GLP-1 total frente a activo, FGF-23 intacto frente a C-terminal, grelina acilada frente a desacil-grelina, BNP frente a NT-proBNP: son mediciones distintas, y el kit informará exactamente de lo que reconozca su par de anticuerpos. Las tablas de reactividad cruzada del prospecto del kit son aquí la especificación, sobre todo en familias como los productos del proglucagón, donde el solapamiento de secuencias es extenso.
La recogida de muestras forma parte del ensayo
Más fallos de kits se deben a la recogida que al propio kit. Varios péptidos se degradan a los pocos minutos de la extracción de sangre a menos que la muestra se proteja: el GLP-1 activo y el GIP requieren un inhibidor de la DPP-4; la acil-grelina requiere acidificación e inhibición de proteasas; la vasopresina es tan inestable que en su lugar se mide la copeptina. La elección del anticoagulante importa, porque un kit validado en plasma con EDTA puede comportarse de otro modo con heparina o con suero. La congelación-descongelación de las muestras degrada muchos analitos, así que divida en alícuotas tanto las muestras como los reactivos. El prospecto del kit indica el protocolo de recogida necesario; tratarlo como opcional invalida la curva patrón que ha pagado.
Cómo realizar bien el ensayo
Cuatro prácticas concentran la mayor parte de la reproducibilidad. Analice patrones y muestras por duplicado y trate un coeficiente de variación superior a aproximadamente el 15 % entre réplicas como un problema de pipeteo o de lavado, no como ruido. Lleve todos los reactivos a la temperatura indicada antes de empezar: las placas y el sustrato fríos producen efectos de borde y cinéticas que derivan a lo largo de la placa. Lave a fondo y de forma homogénea; un lavado incompleto es la causa más frecuente de fondo elevado en los formatos enzimáticos. Y ajuste la curva patrón de forma adecuada: los ensayos competitivos son sigmoideos y necesitan un ajuste logístico de cuatro parámetros, no una regresión lineal por los puntos centrales. Cuando se desconozca la concentración esperada de una diana, analice una serie de diluciones en una muestra piloto antes de comprometer la placa.
Almacenamiento, vida útil y consumibles para kits
Los kits se envían como conjuntos de varios componentes y sus componentes tienen requisitos distintos: la mayoría se conservan a 2–8 °C, y los patrones, controles o conjugados se suministran a menudo liofilizados o congelados. Siga el prospecto componente por componente en lugar de almacenar la caja de forma uniforme. Una vez reconstituido un patrón, su estabilidad es limitada, normalmente unos días a 2–8 °C o una sola congelación en alícuotas; un patrón recongelado es la causa silenciosa de una curva que ya no coincide con la del análisis anterior. Las placas recubiertas son sensibles a la humedad, así que vuelva a sellar las tiras no utilizadas con desecante. La caducidad del kit la fija el componente menos estable, normalmente el conjugado. Los consumibles no incluidos —selladores de placas, tampón de lavado, diluyente— se encuentran en consumibles para kits, y los formatos multiplex basados en perlas utilizan perlas magnéticas en lugar de placas recubiertas. Nuestra guía de ELISA y RIA y el artículo explicativo sobre cómo cuantifican estos kits los péptidos tratan la química subyacente.
Dónde encajan los kits de ensayo frente a los demás tipos de producto
Solicite un kit cuando la pregunta sea la concentración en una muestra. Solicite un anticuerpo cuando la pregunta sea la localización o la identidad en un blot, y un patrón peptídico cuando necesite aplicar una cantidad conocida, añadir un control de recuperación o absorber un anticuerpo. Los péptidos marcados aportan los trazadores utilizados en los formatos competitivos y en el desarrollo de ensayos personalizados. Empiece por el portal del catálogo o por una temática como la diabetes, la cardiovascular o el alzhéimer, en las que la selección del kit soporta la mayor parte del peso analítico. Todos los kits del catálogo son inmunoensayos de investigación suministrados exclusivamente para investigación in vitro y en animales autorizada; ninguno es un diagnóstico validado clínicamente.
Preguntas
¿Qué diferencia hay entre un ensayo tipo sándwich y un ensayo competitivo?
Un ensayo tipo sándwich captura el analito entre dos anticuerpos que se unen a epítopos distintos, por lo que la señal aumenta con la concentración. En un ensayo competitivo, el analito de la muestra compite con una versión marcada por una cantidad limitada de anticuerpo, por lo que la señal disminuye a medida que aumenta la concentración. Los péptidos cortos no pueden acomodar dos anticuerpos a la vez, razón por la cual se miden de forma competitiva.
¿Cómo elijo entre un ELISA y un RIA para la misma diana?
Opte por defecto por el ELISA salvo que la sensibilidad exija lo contrario. El RIA puede ofrecer una mejor sensibilidad para algunos péptidos pequeños y sigue siendo el método de referencia en parte de la literatura, pero requiere una licencia de materiales radiactivos, manipulación con blindaje, un contador gamma y una vía de gestión de residuos, y el trazador de I-125 decae con una semivida de aproximadamente 60 días.
¿Puedo utilizar un kit con un tipo de muestra para el que no está validado?
Solo después de validarlo usted mismo. Realice experimentos de recuperación de adición y de linealidad de la dilución en la nueva matriz: una recuperación cercana al 80–120 % y un comportamiento de dilución paralelo indican que la matriz es aceptable. Sin ello, la interferencia de la matriz puede desplazar los resultados varias veces en cualquier dirección sin ningún signo visible en la placa.
¿Por qué mis duplicados no son coherentes?
Normalmente por el pipeteo o el lavado más que por el kit. Compruebe el ajuste de las puntas y la técnica con volúmenes pequeños, asegúrese de que el lavador de placas dispensa volúmenes uniformes en todos los pocillos y confirme que los reactivos alcanzaron la temperatura indicada antes de su uso. Un coeficiente de variación entre réplicas superior a aproximadamente el 15 % indica un problema de procedimiento que debe corregirse antes de interpretar el análisis.
¿Debo utilizar un ajuste lineal para la curva patrón?
No, en un ensayo competitivo no. Estas curvas son sigmoideas y requieren un ajuste logístico de cuatro parámetros; una regresión lineal por el intervalo medio distorsiona los valores en ambos extremos. La mayoría del software de los lectores de placas incluye el ajuste 4PL. Las curvas de los ELISA tipo sándwich tampoco suelen ser lineales en todo su intervalo.
¿Pueden utilizarse estos kits para diagnosticar algo?
No. Todos los kits del catálogo de investigación son inmunoensayos de investigación para investigación in vitro y en animales autorizada. No son diagnósticos validados clínicamente, y sus resultados carecen de significado diagnóstico.