Czym jest ACE-031? Struktura ActRIIB-Fc, mechanizm i przegląd badań

ACE-031 to rozpuszczalny receptor-wabik: zewnątrzkomórkowa domena wiążąca ligand ludzkiego receptora aktywiny typu IIB połączona z regionem Fc ludzkiej IgG1, wytwarzana jako homodimer połączony mostkami disiarczkowymi. Działa, przechwytując miostatynę i pokrewne ligandy nadrodziny TGF-β w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, zanim dotrą one do receptora błonowego. Opracowany przez Acceleron Pharma i katalogowany również jako ActRIIB-Fc lub ramatercept, doszedł do fazy 2 badań klinicznych i został wycofany z rozwoju w 2013 roku — historia ta ma kluczowe znaczenie dla odczytywania tej cząsteczki w literaturze.

Peptide Medix EU dostarcza ACE-031 jako liofilizowane białko rekombinowane w fiolce 1 mg w ramach oferty peptydów IGF i mięśniowych. Dostarczane wyłącznie do badań laboratoryjnych.

Czym jest ACE-031?

ACE-031 jest białkiem fuzyjnym, a nie peptydem. Definiują je dwa składniki. Pierwszym jest zewnątrzkomórkowa domena ActRIIB, jednego z dwóch receptorów aktywiny typu II, znajdujących się na szczycie kaskady sygnałowej SMAD2/3 w mięśniach szkieletowych. Drugim jest fragment Fc ludzkiej IgG1 — standardowy moduł inżynierii białek, który dodaje jednocześnie dwie właściwości: wymusza dimeryzację, nadając konstruktowi dwa ramiona wiążące ligand, oraz angażuje szlak recyklingu przez noworodkowy receptor Fc, co wydłuża utrzymywanie się w krążeniu z godzin do dni.

W rezultacie powstaje cząsteczka o swoistości wiązania receptora i farmakokinetyce przeciwciała, pozbawiona własnej zdolności sygnalizacyjnej — klasyczny projekt pułapki ligandów. Jako dimeryczna glikoproteina migruje w SDS-PAGE znacznie powyżej 70 kDa, co samo w sobie jest użyteczną kontrolą tożsamości.

Pochodzenie i struktura

Projekt wynika bezpośrednio z genetyki szlaku miostatyny. Miostatyna (GDF-8) jest ujemnym regulatorem masy mięśni szkieletowych; zwierzęta i ludzie z wariantami utraty funkcji wykazują wyraźny przerost mięśni. Ponieważ miostatyna sygnalizuje przez ActRIIB, obecność nadmiaru rozpuszczalnego ActRIIB w przestrzeni zewnątrzkomórkowej konkurencyjnie odciąga ligand od receptora błonowego.

Najważniejszym szczegółem inżynieryjnym jest to, co jeszcze wiąże ActRIIB. Jego naturalny repertuar ligandów obejmuje aktywinę A i aktywinę B, GDF-11 — bliski homolog miostatyny pełniący funkcje w rozwoju — oraz kilka białek morfogenetycznych kości, w tym BMP9 i BMP10. Rozpuszczalna pułapka ActRIIB usuwa zatem z krążenia nie tylko miostatynę, a późniejsze prace inżynieryjne w tej klasie koncentrowały się właśnie na zawężeniu tej wielokierunkowości.

Jak prawdopodobnie działa ACE-031

Mechanizmem jest kompetycyjna sekwestracja ligandów powyżej receptora. Gdy ligand jest związany z pułapką, ActRIIB na powierzchni miocytu nie zostaje zaangażowany, receptor typu I (ALK4/ALK5) nie jest rekrutowany ani fosforylowany, a sygnalizacja SMAD2/3 do jądra słabnie. W modelach mięśniowych opisywano, że znosi to transkrypcyjne hamowanie programów wzrostu i przesuwa równowagę w kierunku sygnalizacji syntezy białek związanej z Akt/mTOR.

Z szerokiego profilu wiązania wynikają dwie konsekwencje mechanistyczne. Po pierwsze, w pracach przedklinicznych obok efektów na mięśnie opisywano efekty na kości, co jest zgodne z udziałem aktywin i BMP w przebudowie kości. Po drugie, i ważniejsze, sygnalizacja BMP9 i BMP10 przez ALK1 w śródbłonku naczyniowym jest uznanym regulatorem integralności naczyń — a zmiany naczyniowe, które zakończyły rozwój kliniczny ACE-031, są w literaturze zwykle przypisywane temu ramieniu, a nie szlakowi mięśniowemu. Dla badacza oznacza to, że ACE-031 jest szerokospektralną pułapką ligandów ActRIIB, a nie narzędziem swoistym dla miostatyny, i rozróżnienie to należy wyraźnie zaznaczać w każdej interpretacji.

W porównaniu z Follistatin-344, która wiąże same ligandy, oraz z propeptydem GDF-8 / miostatyny, który jest naturalnym inhibitorem tego liganda i najbardziej selektywnym z tej trójki, ACE-031 blokuje oś na styku z receptorem. Wybór między nimi to rzeczywista decyzja doświadczalna o tym, w którym miejscu szlaku ma nastąpić interwencja.

Co zbadano

Przedkliniczne modele mięśni i kości

Badania na gryzoniach z rozpuszczalnymi konstruktami ActRIIB-Fc wykazywały znaczne zwiększenie beztłuszczowej masy ciała i wielkości włókien mięśniowych, w tym w modelach dystrofii i kacheksji, a odrębne badania opisywały wzrost gęstości mineralnej kości. To te wyniki zmotywowały rozwój kliniczny.

Farmakologia u ludzi w fazie 1

Badanie fazy 1 u zdrowych ochotniczek po menopauzie opisywało wzrost beztłuszczowej masy ciała oraz zmiany markerów tworzenia kości i masy tłuszczowej po jednorazowym podaniu, wraz z danymi farmakokinetycznymi zgodnymi z wydłużonym przez Fc okresem półtrwania. Jest to najwyraźniejszy opublikowany dowód u ludzi, że mechanizm angażuje swój cel.

Badania w dystrofii mięśniowej Duchenne'a i przerwanie rozwoju

Program fazy 2 u chłopców z dystrofią mięśniową Duchenne'a został wstrzymany w 2013 roku. Podanym powodem nie był brak efektu mięśniowego, lecz zmiany pozamięśniowe — krwawienia z nosa, krwawienia z dziąseł i poszerzone naczynia powierzchowne — zgodne z zaburzeniem naczyniowej sygnalizacji BMP9/BMP10–ALK1. Rozwój ACE-031 nie został wznowiony. Każde badawcze zastosowanie tej cząsteczki powinno uwzględniać ten wynik.

Cząsteczki następcze

Na tym klasa się nie skończyła. Następnie opracowano bardziej selektywne środki skierowane na ActRII, w tym projektowane pułapki ligandów o zawężonych profilach wiązania i monoklonalne przeciwciała przeciwko receptorowi, a kilka z nich uzyskało dopuszczenie w hematologii i wskazaniach płucnych. ACE-031 najlepiej rozumieć jako związek pierwszej generacji, którego ograniczenia wyznaczyły późniejsze projekty.

Dostarczane postacie i wielkości

Fiolka 1 mg to duża ilość molowa w przypadku białka stosowanego w nanomolowych stężeniach roboczych, dlatego podział na porcje całej fiolki przy pierwszej rekonstytucji jest normalną praktyką. Kwestie związane z zakupem omówiono w naszym przewodniku zakupowym ACE-031.

Rekonstytucja i przechowywanie w warunkach laboratoryjnych

Białka fuzyjne Fc to najbardziej delikatna kategoria materiałów w katalogu peptydów i odpowiednio się z nimi obchodzi. Wodę sterylną lub bakteriostatyczną dodaje się powoli po ściance fiolki i pozostawia fiolkę do odstania; worteksowanie lub wstrząsanie dużej glikoproteiny powoduje agregację wywołaną naprężeniami ścinającymi, której żadne dalsze mieszanie nie odwróci. Utrzymujące się zmętnienie po rozpuszczeniu wskazuje na tworzenie agregatów i należy je traktować jako problem jakościowy, a nie problem z mieszaniem.

Obliczenia stężenia są proste — 1 mg uzupełniony do 1 mL to 1 mg/mL, a 0.1 mL zawiera 100 mcg — ale doświadczalne stężenia robocze są znacznie niższe, a przy nich straty wynikają głównie z adsorpcji na tworzywie sztucznym i szkle. Standardem jest białko nośnikowe, np. 0.1% albumina surowicy bydlęcej w rozcieńczonych roztworach, a preferowane są probówki o niskim wiązaniu. Ogólną metodę opisano w naszym przewodniku po rekonstytucji.

Liofilizowane fiolki przechowuje się w −20 °C, szczelnie zamknięte i chronione przed światłem i wilgocią. Materiał po rekonstytucji stosuje się w 2–8 °C do bieżącej pracy lub dzieli na porcje i zamraża; wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie białka fuzyjnego Fc niezawodnie powoduje powstawanie agregatów i utratę aktywności. Szersze wskazówki zawiera artykuł jak przechowywać peptydy.

Czystość, COA i jak go czytać

Certyfikat białka fuzyjnego zawiera inne informacje niż certyfikat peptydu, a najbardziej informatywne są sekcje inne niż HPLC. SDS-PAGE w warunkach redukujących i nieredukujących powinna wykazać monomer i dimer połączony mostkami disiarczkowymi w oczekiwanych rozmiarach; ścieżka nieredukująca, na której dominuje monomer, wskazuje na konstrukt, który nie złożył się prawidłowo. Chromatografia wykluczania, jeśli jest podana, określa ilościowo agregaty wielkocząsteczkowe, które najczęściej wyjaśniają nieaktywną fiolkę. Należy podać system ekspresji i status glikozylacji, a zawartość endotoksyn ma znaczenie w każdym teście komórkowym. Wartość bioaktywności z testu wiązania lub testu reporterowego jest bardziej miarodajna niż jakikolwiek procent czystości. Nasz przewodnik po czytaniu certyfikatu analizy omawia, jak te sekcje się ze sobą wiążą.

Status regulacyjny

ACE-031 nie ma nigdzie pozwolenia na dopuszczenie do obrotu. Rozwój kliniczny przerwano w 2013 roku i nie został wznowiony, więc nie istnieje produkt referencyjny ani zatwierdzona charakterystyka tej cząsteczki. Środki działające na szlak miostatyny są zakazane w sporcie na mocy przepisów antydopingowych.

Cząsteczki pokrewne i dalsza lektura

Dwa inne sposoby blokowania tej osi dostępne w naszym katalogu to Follistatin-344, szeroka pułapka ligandów, oraz propeptyd GDF-8 / miostatyny, najbardziej selektywny wobec liganda w tej grupie. Szerszy kontekst tego, jak łączą się ze sobą rodziny badawcze związane z mięśniami, przedstawia nasz przegląd peptydów w badaniach nad wzrostem mięśni.