Investigação de péptidos em Alzheimer e neurodegeneração: guia do catálogo de investigação

A investigação sobre a doença de Alzheimer e a neurodegeneração neste catálogo organiza-se em torno de três sistemas de agregação proteica — beta-amiloide, tau e alfa-sinucleína — a que se somam as neurotrofinas, os marcadores sinápticos e os reagentes das vias de processamento utilizados para caracterizar o que acontece à sua volta. A nossa página temática de Alzheimer reúne os padrões peptídicos, antissoros, traçadores marcados e kits de imunoensaio para esse trabalho. Este guia mapeia as famílias, explica por que razão o comportamento de agregação torna estes péptidos mais difíceis de manusear do que quaisquer outros do catálogo e indica que formato de reagente responde a que pergunta.

O que se inclui no tema Alzheimer

As famílias são aqui classificadas quando o péptido ou a proteína de origem é uma espécie de agregação, um intermediário de processamento, um marcador sináptico ou neuronal, ou um fator trófico utilizado em modelos de neurodegeneração. Isto abrange a via da proteína precursora da amiloide, as tauopatias, as sinucleinopatias, a biologia dos priões enquanto modelo mecanístico do enrolamento incorreto por molde e as famílias de neurotrofinas utilizadas para avaliar a sobrevivência neuronal. A sobreposição com o tema dos neuropéptidos é considerável, uma vez que a somatostatina e a galanina, marcadores de interneurónios, são leituras padrão nestes modelos. Todos os artigos são fornecidos exclusivamente para investigação in vitro e investigação animal aprovada.

Beta-amiloide e a via da APP

• Beta-amiloide — a família central: Aβ(1–40), Aβ(1–42), Aβ(1–43), o controlo invertido Aβ(42–1), espécies truncadas e piroglutamiladas e versões com marcação fluorescente. O Aβ42 agrega muito mais depressa do que o Aβ40, razão pela qual os dois nunca são intercambiáveis num ensaio de agregação.
• Aβ40 S26C — uma variante com substituição por cisteína utilizada para preparar dímeros estabilizados covalentemente, uma das ferramentas padrão para distinguir os efeitos dos oligómeros dos efeitos das fibrilas.
• APLP — proteínas semelhantes à precursora da amiloide, membros da família da APP utilizados para testar se uma observação é específica da APP.
• AICD — o domínio intracelular da APP libertado pela gama-secretase, estudado como fragmento de sinalização por direito próprio.
• Presenilina — o núcleo catalítico da gama-secretase; os reagentes peptídicos apoiam estudos de locais de clivagem e de inibidores.
• SORL1 (SorLA) — um recetor de tráfego da APP e um gene de risco confirmado para a doença de Alzheimer, cada vez mais encomendado à medida que cresce a literatura de base genética.

Famílias da tau, da sinucleína e dos priões

• Tau — isoformas completas, os fragmentos do domínio de repetição que formam o núcleo das fibrilas e padrões fosfopeptídicos correspondentes aos fosfoepítopos de diagnóstico. A especificidade do local de fosforilação é a razão de ser da maioria dos antissoros anti-tau, pelo que a especificação do epítopo importa mais do que o nome da família.
• Alfa-sinucleína — padrões de monómero, sequências mutantes familiares e os fragmentos da região NAC utilizados em trabalho de agregação; central nos modelos de Parkinson e de corpos de Lewy, bem como em patologia mista.
• Proteína priónica — fragmentos de PrP, incluindo o péptido neurotóxico PrP(106–126), utilizados tanto na investigação de priões como enquanto modelo mecanístico do enrolamento proteico incorreto por molde em geral.
• CHIP — a ubiquitina-ligase co-chaperona que direciona a tau e a sinucleína mal enroladas para degradação; um reagente de proteostase e não uma espécie de agregação.

Famílias neurotróficas, sinápticas e neuroprotetoras

• BDNF e NGF — as duas neurotrofinas mais encomendadas, utilizadas como fatores de sobrevivência em cultura primária e como biomarcadores de plasticidade em tecido de modelo.
• Família das neurotrofinas — NT-3, NT-4/5 e as pró-formas, cuja sinalização oposta via p75 constitui uma questão de investigação distinta.
• CNTF — fator neurotrófico ciliar, e origem de vários fragmentos peptídicos neuroprotetores desenhados.
• Neurogranina — uma proteína pós-sináptica de ligação à calmodulina e um dos marcadores de degeneração sináptica mais bem estabelecidos em estudos de LCR.
• Humanina — um péptido de origem mitocondrial identificado originalmente numa triagem de fatores protetores contra a toxicidade do Aβ; o membro fundador do grupo dos péptidos mitocondriais.
• Nogo — inibidor do crescimento de neurites associado à mielina, utilizado em estudos de regeneração e plasticidade.
• Somatostatina e galanina — populações de interneurónios alteradas de forma reprodutível em tecido de modelos de Alzheimer, encomendadas como marcadores imuno-histoquímicos.

Que formatos contém o tema Alzheimer

Os padrões peptídicos sintéticos fornecem as próprias espécies de agregação, bem como calibradores fosfopeptídicos e péptidos de bloqueio. Os péptidos marcados são muito utilizados: Aβ fluorescente para imagiologia de captação e depuração, péptidos biotinilados para pull-down de parceiros de ligação. Os antissoros policlonais asseguram a maior parte do trabalho de deteção e, neste tema, o epítopo e a fosfoespecificidade definem o reagente — um anticorpo pan-tau e um anticorpo anti-pT181 respondem a perguntas diferentes. Os kits ELISA quantificam Aβ40, Aβ42, tau total e fosfo-tau e neurogranina em LCR, plasma e homogeneizado cerebral; a razão Aβ42/Aβ40 é a leitura padrão reportada, e não cada um dos valores isoladamente. As esferas magnéticas apoiam a imunoprecipitação de agregados e as bibliotecas de péptidos servem o mapeamento de epítopos na tau e na sinucleína.

Como os laboratórios escolhem dentro de uma família

O estado de agregação é a experiência. Preparações de monómero, oligómero e fibrila da mesma sequência produzem resultados diferentes, e nenhum artigo de catálogo pode fornecer «oligómeros» como produto estável — estes são preparados a partir do monómero segundo um protocolo definido. Encomende monómero bem caracterizado e gere as espécies de que necessita. Em segundo lugar, a variante de sequência: Aβ40 versus Aβ42, piroglutamilado versus N-terminal completo, sinucleína de tipo selvagem versus mutante familiar. A especificação do epítopo vem em terceiro lugar para os anticorpos — local de fosforilação, reconhecimento conformacional versus linear e reatividade de espécie confirmada. Em quarto lugar, para determinar a concentração numa amostra, um kit validado é mais rápido e muito mais reprodutível do que montar componentes; utilize péptido mais antissoro para localização e estudo de mecanismos.

Notas de manuseamento para este tema

A beta-amiloide é o péptido mais sensível ao manuseamento deste catálogo, e a maior parte da irreprodutibilidade na literatura deve-se à preparação e não à biologia. A abordagem padrão consiste em desagregar o péptido liofilizado em hexafluoroisopropanol, evaporar até formar uma película e conservar essa película dessecada a −20 °C ou menos; em seguida, ressuspender em DMSO imediatamente antes da utilização e diluir no tampão — nunca reconstitua o Aβ42 diretamente em tampão aquoso esperando obter um monómero. Prepare no momento, utilize uma única vez e registe o protocolo na secção de métodos, porque é ele que determina o resultado. A tau e a sinucleína são mais tolerantes, mas também agregam com ciclos de congelação-descongelação. As boas práticas gerais constam do guia de solubilidade, do guia de armazenamento, do guia de aliquotagem e, para verificar o conteúdo, do guia do COA.

Próximos passos

Consulte o tema Alzheimer completo, o hub dedicado ao cérebro ou a nossa visão geral dos reagentes de beta-amiloide, tau e alfa-sinucleína. Guias adjacentes abordam a secção de neuropéptidos e o guia do tipo anticorpos, que aqui é mais relevante do que na maioria dos temas.