Investigação de péptidos antimicrobianos: guia do catálogo de investigação

A investigação de péptidos antimicrobianos assenta numa lógica diferente da farmacologia de recetores que rege a maior parte deste catálogo. Os péptidos antimicrobianos (AMP) são tipicamente catiónicos e anfipáticos, e o seu principal mecanismo relatado é físico — a partição para membranas bacterianas aniónicas e a sua permeabilização — e não a ligação a um recetor definido. A nossa página temática antimicrobiana reúne os padrões peptídicos, antissoros e kits de imunoensaio utilizados nessa literatura, desde os péptidos humanos de defesa do hospedeiro até aos AMP de insetos e anfíbios. Este guia mapeia as famílias, os formatos e o manuseamento específico dos ensaios que o trabalho com AMP exige.

O que se inclui no tema antimicrobiano

Uma família é aqui classificada quando o seu péptido de origem tem atividade antibacteriana, antifúngica ou antiviral documentada, ou quando funciona como parte da defesa imunitária inata. Isso inclui as duas famílias humanas clássicas — catelicidinas e defensinas —, bem como AMP específicos de tecidos, péptidos de retenção de ferro, péptidos de invertebrados e anfíbios utilizados como modelos mecanísticos e os agonistas de recetores que ligam os AMP à sinalização inflamatória. Muitos destes péptidos são também imunomoduladores, pelo que o tema se sobrepõe à investigação imunitária em geral. Todos os artigos são fornecidos exclusivamente para investigação in vitro e em animais devidamente aprovada; nada aqui é um produto anti-infecioso.

Famílias humanas de defesa do hospedeiro

• LL-37 — a única catelicidina humana, os 37 resíduos C-terminais do hCAP18. É o AMP mais encomendado do catálogo, estudado pela atividade membranar, pela neutralização do LPS, pela quimiotaxia via FPR2 e pela sinalização na reparação de feridas. As variantes truncadas e de sequência baralhada estão disponíveis como controlos mecanísticos.
• Defensinas — α-defensinas (HNP-1 a HNP-4, HD-5, HD-6) e β-defensinas (hBD-1 a hBD-4), distinguidas pela sua conectividade de dissulfuretos. As três pontes dissulfureto são requisitos estruturais, pelo que as formas oxidada e linearizada são reagentes verdadeiramente diferentes.
• Dermicidina — um AMP aniónico do suor écrino, uma exceção instrutiva à regra catiónica e um comparador comum em estudos de mecanismo.
• Péptidos LEAP — péptidos antimicrobianos expressos no fígado, incluindo a hepcidina (LEAP-1), que se situa na interseção entre a defesa antimicrobiana e a regulação do ferro e é medida num grande número de estudos de fenotipagem.
• Lipocalina-2 (NGAL) — uma proteína sequestradora de sideróforos que priva as bactérias de ferro; um reagente de imunidade nutricional e não de lise membranar.
• Intelectina — uma lectina que se liga a glicanos microbianos, encomendada para estudos de reconhecimento de padrões.
• Fator antissecretor — estudado na secreção de fluido entérico e em modelos de doença inflamatória intestinal.

Famílias de AMP de modelo e de comparação

• CRAMP — a catelicidina do ratinho, ortóloga do LL-37. Qualquer estudo murino da biologia das catelicidinas necessita de CRAMP e não de LL-37: as sequências diferem substancialmente e a atividade não se transfere.
• Apidaecina — um AMP de inseto rico em prolina que atua intracelularmente sobre o ribossoma e não por lise, sendo por isso o comparador padrão na distinção entre mecanismos líticos e não líticos.
• Bombinacinina — péptidos da pele de anfíbios do género Bombina, uma fonte rica tanto de AMP como de péptidos relacionados com a bradicinina.
• AMP-IBP5 — um péptido antimicrobiano derivado da proteína de ligação ao IGF-5, um exemplo de atividade AMP que emerge de um fragmento de uma proteína não imunitária.

Acompanhantes na sinalização imunitária inata

• fMLF (fMLP) e WKYMVm — agonistas dos recetores de péptidos formilados utilizados como controlos de quimiotaxia de neutrófilos, e os ligandos de referência padrão ao testar se um AMP atua através do FPR1 ou do FPR2.
• Reagentes relacionados com o peptidoglicano — componentes da parede celular bacteriana utilizados como estímulos de recetores de reconhecimento de padrões a par do trabalho com AMP.
• Ac2-26 — o péptido da anexina A1, um agonista pró-resolutivo do FPR2 frequentemente associado a estudos com LL-37, porque ambos convergem no mesmo recetor.
• Famílias das interleucinas e das CXCL — várias quimiocinas têm atividade antimicrobiana direta, e as leituras de citocinas são a medição habitual a jusante em estudos de imunomodulação por AMP.

Que formatos contém o tema antimicrobiano

Os padrões peptídicos sintéticos são o núcleo deste tema e são encomendados em maior escala do que noutros, porque os ensaios de concentração inibitória mínima consomem material — os enchimentos de miligramas são a norma e não a exceção. Os péptidos marcados são importantes para o mecanismo: os AMP com marcação fluorescente são utilizados em microscopia de localização na membrana bacteriana, e as versões biotiniladas para pull-down de parceiros de ligação. Os antissoros policlonais apoiam a deteção tecidular da expressão endógena de AMP, que é a forma como a maioria dos artigos sobre defesa do hospedeiro demonstra a indução. Os kits ELISA quantificam o LL-37, a hepcidina, a lipocalina-2 e as beta-defensinas no plasma, na expetoração e no sobrenadante de cultura. As bibliotecas de péptidos apoiam o rastreio de relação estrutura-atividade, que é a principal via para análogos de AMP concebidos.

Como os laboratórios escolhem dentro de uma família

A espécie em primeiro lugar, e de forma mais estrita do que noutros temas. O LL-37 e o CRAMP não são intermutáveis, e utilizar o péptido humano num modelo de ratinho é uma fonte reconhecida de resultados ininterpretáveis. O estado de oxidação em segundo lugar: as defensinas requerem o emparelhamento correto das pontes dissulfureto, e uma entrada do catálogo deve indicar se o péptido é fornecido oxidado e enrolado ou na forma linear. O contraião em terceiro, e esta é a armadilha específica dos AMP: o TFA residual da síntese é ele próprio antimicrobiano e citotóxico nas concentrações utilizadas nos ensaios de AMP, pelo que o material com troca para acetato é o padrão para trabalho de CIM e de viabilidade celular. A pureza e o teor em quarto: um AMP indicado com 95% de pureza pode ter substancialmente menos de 95% de péptido em massa, uma vez contabilizados o sal e a água, o que altera todos os valores de CIM relatados. O guia do COA explica o teor de péptido face ao peso bruto.

Notas de manuseamento para este tema

Os péptidos catiónicos adsorvem fortemente ao poliestireno e às pontas de plástico, e as perdas em concentrações micromolares baixas são suficientemente grandes para alterar uma CIM numa diluição ou mais — deve utilizar-se polipropileno, pontas de baixa ligação ou um transportador como ácido acético a 0,01% com BSA, quando o ensaio o tolerar. A composição do meio é importante: o caldo Mueller-Hinton ajustado em catiões, que é o padrão, suprime a atividade dos AMP em comparação com meios de baixo teor salino, razão pela qual os artigos sobre AMP especificam o meio com tanto cuidado. Quanto ao resto, aplica-se o habitual — frascos liofilizados selados a −20 °C, alíquotas de utilização única, mínimo de ciclos de congelação-descongelação e atenção à solubilidade das sequências hidrofóbicas (solubilidade de péptidos, guia de armazenamento, guia de aliquotagem).

Para onde ir a seguir

Consulte o tema antimicrobiano completo, o portal do sistema imunitário ou o portal da pele, onde é estudada a maior parte da expressão humana de AMP. Os guias afins abrangem o guia do tipo péptidos de investigação para a leitura de especificações e a secção de oncologia, que partilha as famílias de quimiocinas.