Peptydy w badaniach nad chorobą Alzheimera i neurodegeneracją: przewodnik po katalogu badawczym

Badania nad chorobą Alzheimera i neurodegeneracją w tym katalogu koncentrują się na trzech układach agregacji białek — amyloidzie beta, białku tau i alfa-synukleinie — a także na neurotrofinach, markerach synaptycznych i odczynnikach szlaków przetwarzania, służących do charakteryzowania procesów zachodzących wokół nich. Nasza strona tematyczna dotycząca choroby Alzheimera gromadzi wzorce peptydowe, antysurowice, znakowane znaczniki i zestawy immunologiczne do tych prac. Niniejszy przewodnik porządkuje rodziny, wyjaśnia, dlaczego skłonność do agregacji sprawia, że peptydy te są trudniejsze w obsłudze niż jakiekolwiek inne w katalogu, oraz wskazuje, który format odczynnika odpowiada na które pytanie.

Co obejmuje temat choroby Alzheimera

Rodziny trafiają tutaj, gdy macierzysty peptyd lub białko jest formą agregującą, produktem pośrednim przetwarzania, markerem synaptycznym lub neuronalnym albo czynnikiem troficznym stosowanym w modelach neurodegeneracji. Obejmuje to szlak białka prekursorowego amyloidu, tauopatie, synukleinopatie, biologię prionów jako mechanistyczny wzorzec matrycowego nieprawidłowego fałdowania oraz rodziny neurotrofin stosowane do oceny przeżywalności neuronów. Nakładanie się z tematem neuropeptydów jest znaczne, ponieważ markery interneuronów — somatostatyna i galanina — są standardowymi odczytami w tych modelach. Każdy produkt jest dostarczany wyłącznie do badań in vitro oraz zatwierdzonych badań na zwierzętach.

Amyloid beta i szlak APP

• Amyloid beta — rodzina centralna: Aβ(1–40), Aβ(1–42), Aβ(1–43), odwrócona kontrola Aβ(42–1), formy skrócone i z piroglutaminianem oraz wersje znakowane fluorescencyjnie. Aβ42 agreguje znacznie szybciej niż Aβ40, dlatego obu form nigdy nie można stosować zamiennie w teście agregacji.
• Aβ40 S26C — wariant z podstawieniem cysteiną, używany do przygotowania kowalencyjnie stabilizowanych dimerów; jedno ze standardowych narzędzi do oddzielania efektów oligomerów od efektów włókienek.
• APLP — białka podobne do prekursora amyloidu, członkowie rodziny APP stosowani do sprawdzenia, czy obserwacja jest swoista dla APP.
• AICD — wewnątrzkomórkowa domena APP uwalniana przez gamma-sekretazę, badana jako samodzielny fragment sygnałowy.
• Presenilina — rdzeń katalityczny gamma-sekretazy; odczynniki peptydowe wspierają badania miejsc cięcia i inhibitorów.
• SORL1 (SorLA) — receptor transportu APP i potwierdzony gen ryzyka choroby Alzheimera, coraz częściej zamawiany w miarę rozwoju literatury opartej na genetyce.

Rodziny tau, synukleiny i prionów

• Tau — izoformy pełnej długości, fragmenty domeny powtórzeń tworzące rdzeń włókienek oraz wzorce fosfopeptydowe odpowiadające diagnostycznym fosfoepitopom. Swoistość względem miejsca fosforylacji jest istotą większości antysurowic przeciw tau, dlatego specyfikacja epitopu ma większe znaczenie niż nazwa rodziny.
• Alfa-synukleina — wzorce monomerów, sekwencje mutantów rodzinnych i fragmenty regionu NAC stosowane w pracach nad agregacją; kluczowa dla modeli choroby Parkinsona i choroby z ciałami Lewy'ego, a także patologii mieszanej.
• Białko prionowe — fragmenty PrP, w tym neurotoksyczny peptyd PrP(106–126), stosowane zarówno w badaniach nad prionami, jak i jako mechanistyczny wzorzec matrycowego nieprawidłowego fałdowania białek w ogóle.
• CHIP — ko-chaperonowa ligaza ubikwityny kierująca nieprawidłowo sfałdowane tau i synukleinę do degradacji; odczynnik proteostazy, a nie forma agregująca.

Rodziny neurotroficzne, synaptyczne i neuroprotekcyjne

• BDNF i NGF — dwie najczęściej zamawiane neurotrofiny, stosowane jako czynniki przeżycia w hodowlach pierwotnych i jako biomarkery plastyczności w tkance modelowej.
• Rodzina neurotrofin — NT-3, NT-4/5 i proformy, których przeciwstawna sygnalizacja przez p75 stanowi odrębne zagadnienie badawcze.
• CNTF — rzęskowy czynnik neurotroficzny, będący źródłem kilku zaprojektowanych neuroprotekcyjnych fragmentów peptydowych.
• Neurogranina — postsynaptyczne białko wiążące kalmodulinę i jeden z lepiej ugruntowanych markerów degeneracji synaps w badaniach płynu mózgowo-rdzeniowego.
• Humanina — peptyd pochodzenia mitochondrialnego, pierwotnie zidentyfikowany w przesiewie czynników chroniących przed toksycznością Aβ; założycielski członek grupy peptydów mitochondrialnych.
• Nogo — związany z mieliną inhibitor wzrostu neurytów, stosowany w badaniach regeneracji i plastyczności.
• Somatostatyna i galanina — populacje interneuronów powtarzalnie zmienione w tkance modeli choroby Alzheimera, zamawiane jako markery immunohistochemiczne.

Jakie formaty obejmuje temat choroby Alzheimera

Syntetyczne wzorce peptydowe dostarczają samych form agregujących, a także kalibratorów fosfopeptydowych i peptydów blokujących. Intensywnie wykorzystywane są peptydy znakowane: fluorescencyjny Aβ do obrazowania wychwytu i klirensu, peptydy biotynylowane do wychwytywania (pull-down) partnerów wiązania. Poliklonalne antysurowice realizują większość prac detekcyjnych, a w tym temacie o odczynniku decyduje epitop i swoistość względem fosforylacji — przeciwciało pan-tau i przeciwciało pT181 odpowiadają na różne pytania. Zestawy ELISA oznaczają ilościowo Aβ40, Aβ42, tau całkowite i fosforylowane oraz neurograninę w płynie mózgowo-rdzeniowym, osoczu i homogenacie mózgu; standardowo raportowanym odczytem jest stosunek Aβ42/Aβ40, a nie każda z wartości osobno. Kulki magnetyczne służą do immunoprecypitacji agregatów, a biblioteki peptydowe — do mapowania epitopów tau i synukleiny.

Jak laboratoria dokonują wyboru w obrębie rodziny

Stan agregacji jest właściwym eksperymentem. Preparaty monomeru, oligomerów i włókienek tej samej sekwencji dają różne wyniki, a żaden produkt katalogowy nie może dostarczyć „oligomerów” jako stabilnego produktu — przygotowuje się je z monomeru według zdefiniowanego protokołu. Należy zamówić dobrze scharakteryzowany monomer i wytworzyć potrzebne formy. Na drugim miejscu jest wariant sekwencji: Aβ40 wobec Aβ42, forma z piroglutaminianem wobec pełnego N-końca, synukleina typu dzikiego wobec mutanta rodzinnego. Specyfikacja epitopu to trzecie kryterium w przypadku przeciwciał — miejsce fosforylacji, rozpoznawanie konformacyjne czy liniowe oraz potwierdzona reaktywność gatunkowa. Po czwarte, do oznaczania stężenia w próbce zwalidowany zestaw jest szybszy i znacznie bardziej powtarzalny niż składanie testu z komponentów; peptyd wraz z antysurowicą należy stosować do badań lokalizacji i mechanizmu.

Uwagi dotyczące obsługi w tym temacie

Amyloid beta jest najbardziej wrażliwym na sposób obsługi peptydem w tym katalogu, a większość braku powtarzalności w literaturze wynika z przygotowania preparatu, a nie z biologii. Standardowe postępowanie polega na dezagregacji liofilizowanego peptydu w heksafluoroizopropanolu, odparowaniu do postaci filmu i przechowywaniu tego filmu w warunkach suchych w temperaturze −20 °C lub niższej, a następnie ponownym zawieszeniu w DMSO bezpośrednio przed użyciem i rozcieńczeniu w buforze — nigdy nie należy rekonstytuować Aβ42 bezpośrednio w buforze wodnym, oczekując uzyskania monomeru. Preparat należy przygotowywać na świeżo, używać jednorazowo i opisać protokół w metodyce, ponieważ to on determinuje wynik. Tau i synukleina są mniej wymagające, ale również agregują przy cyklach zamrażania i rozmrażania. Ogólne zasady opisano w przewodniku po rozpuszczalności, przewodniku po przechowywaniu, przewodniku po porcjowaniu oraz — w zakresie weryfikacji zawartości — w przewodniku po COA.

Co dalej

Warto przejrzeć pełny temat choroby Alzheimera, centrum tematyczne mózgu lub nasze omówienie odczynników dotyczących amyloidu beta, tau i alfa-synukleiny. Pokrewne przewodniki obejmują sekcję neuropeptydów oraz przewodnik po typie „przeciwciała”, który ma tu większe znaczenie niż w większości tematów.