Glossário
Marcação com biotina
A biotinilação dá a um péptido uma âncora femtomolar para captura com estreptavidina. Espaçador, biotina endógena e limites de eluição explicados.
Uma marcação com biotina é uma molécula de biotina (vitamina B7) conjugada a um péptido, normalmente no terminal N ou numa cadeia lateral de lisina. O seu valor reside na interação com a estreptavidina: uma constante de dissociação na gama femtomolar, uma das ligações não covalentes mais fortes da biologia, estável face a detergentes, elevada força iónica e desnaturantes moderados.
Como se utiliza e o que a limita
Os péptidos biotinilados são a ferramenta padrão para ensaios de pull-down e identificação de alvos em esferas magnéticas de estreptavidina, para imobilização em placas de ELISA e chips de SPR revestidos com estreptavidina, e para deteção amplificada em que um conjugado estreptavidina-HRP substitui um anticorpo secundário marcado.
Há três limitações práticas recorrentes. Primeiro, o comprimento do espaçador: a cauda de ácido valérico da biotina é curta e a bolsa de ligação é profunda, pelo que normalmente se insere um ligante de ácido amino-hexanoico ou de PEG para manter o péptido acessível. Segundo, a biotina endógena: tecidos como o fígado, o rim e o cérebro contêm biotina livre suficiente para competir, exigindo um passo de bloqueio avidina/biotina. Terceiro, a eluição: a interação é tão forte que a recuperação de complexos intactos exige geralmente ebulição em SDS, excesso de biotina livre com incubação prolongada ou um ligante clivável concebido desde o início.
Termos e material relacionados
marcação FAM/FITC · marcação radioativa com I-125 · pureza. Material de referência: péptidos marcados, anticorpos marcados. Leitura complementar: guia de péptidos marcados.