Výzkum antimikrobiálních peptidů: průvodce výzkumným katalogem

Výzkum antimikrobiálních peptidů funguje podle jiné logiky než receptorová farmakologie, jíž se řídí většina tohoto katalogu. Antimikrobiální peptidy (AMP) jsou obvykle kationtové a amfipatické a jejich primárním popisovaným mechanismem je fyzikální děj – zanoření do aniontových bakteriálních membrán a jejich permeabilizace – nikoli vazba na definovaný receptor. Naše tematická stránka antimikrobiálních peptidů shromažďuje peptidové standardy, antiséra a imunoanalytické kity používané v této literatuře, od lidských obranných peptidů hostitele po AMP hmyzu a obojživelníků. Tento průvodce mapuje rodiny, formy a zacházení specifické pro testy, které práce s AMP vyžaduje.

Co spadá pod antimikrobiální téma

Rodina je zde zařazena, pokud má její výchozí peptid zdokumentovanou antibakteriální, antimykotickou nebo antivirovou aktivitu, nebo pokud funguje jako součást vrozené imunitní obrany. To zahrnuje dvě klasické lidské rodiny – katelicidiny a defenziny – a dále tkáňově specifické AMP, peptidy zadržující železo, peptidy bezobratlých a obojživelníků používané jako mechanistické modely a agonisty receptorů, které propojují AMP se zánětlivou signalizací. Mnoho z těchto peptidů je zároveň imunomodulátory, takže se téma obecně překrývá s imunitním výzkumem. Každá položka se dodává výhradně pro výzkum in vitro a schválený výzkum na zvířatech; nic zde není protiinfekčním přípravkem.

Lidské rodiny obrany hostitele

• LL-37 – jediný lidský katelicidin, C-koncových 37 zbytků hCAP18. Je nejčastěji objednávaným AMP v katalogu, studovaným pro membránovou aktivitu, neutralizaci LPS, chemotaxi přes FPR2 a signalizaci hojení ran. Jako mechanistické kontroly jsou skladem zkrácené a skramblované varianty.
• Defenziny – α-defenziny (HNP-1 až HNP-4, HD-5, HD-6) a β-defenziny (hBD-1 až hBD-4), odlišené propojením disulfidových vazeb. Tři disulfidové můstky jsou strukturním požadavkem, takže oxidované a linearizované formy jsou skutečně odlišné reagencie.
• Dermcidin – aniontový AMP z ekrinního potu, poučná výjimka z kationtového pravidla a častý komparátor v mechanistických studiích.
• Peptidy LEAP – antimikrobiální peptidy exprimované v játrech, včetně hepcidinu (LEAP-1), který stojí na průsečíku antimikrobiální obrany a regulace železa a měří se ve velkém množství fenotypizačních studií.
• Lipokalin-2 (NGAL) – protein vychytávající siderofory, který bakterie vyhladovuje o železo; reagencie nutriční imunity, nikoli membránově lytická.
• Intelektin – lektin vážící mikrobiální glykany, objednávaný pro studie rozpoznávání vzorů.
• Antisekreční faktor – studovaný v modelech střevní sekrece tekutin a zánětlivých onemocnění střev.

Modelové a srovnávací rodiny AMP

• CRAMP – myší katelicidinový ortolog LL-37. Každá myší studie biologie katelicidinu potřebuje CRAMP, nikoli LL-37: sekvence se podstatně liší a aktivita se nepřenáší.
• Apidaecin – hmyzí AMP bohatý na prolin, který působí intracelulárně na ribozom, nikoli lýzou, a je proto standardním komparátorem při rozlišování lytických a nelytických mechanismů.
• Bombinakinin – kožní peptidy obojživelníků rodu Bombina, bohatý zdroj AMP i peptidů příbuzných bradykininu.
• AMP-IBP5 – antimikrobiální peptid odvozený od proteinu 5 vázajícího IGF, příklad antimikrobiální aktivity vznikající z fragmentu neimunitního proteinu.

Doprovodné látky signalizace vrozené imunity

• fMLF (fMLP) a WKYMVm – agonisté formylpeptidových receptorů používaní jako kontroly chemotaxe neutrofilů a standardní referenční ligandy při testování, zda AMP působí přes FPR1, nebo FPR2.
• Reagencie příbuzné peptidoglykanu – složky bakteriální buněčné stěny používané jako stimuly receptorů rozpoznávajících vzory souběžně s prací na AMP.
• Ac2-26 – peptid anexinu A1, proresoluční agonista FPR2, často kombinovaný se studiemi LL-37, protože oba konvergují na stejném receptoru.
• Rodiny interleukinů a CXCL – několik chemokinů má přímou antimikrobiální aktivitu a cytokinové parametry jsou obvyklým následným měřením ve studiích imunomodulace pomocí AMP.

Jaké formy antimikrobiální téma obsahuje

Jádrem tohoto tématu jsou syntetické peptidové standardy, které se objednávají ve větším měřítku než jinde, protože testy minimální inhibiční koncentrace spotřebovávají materiál – miligramová balení jsou spíše pravidlem než výjimkou. Pro mechanismus jsou důležité značené peptidy: fluorescenčně značené AMP se používají pro mikroskopickou lokalizaci na bakteriálních membránách a biotinylované verze pro pull-down vazebných partnerů. Polyklonální antiséra podporují tkáňovou detekci exprese endogenních AMP, čímž většina prací o obraně hostitele dokládá indukci. ELISA kity kvantifikují LL-37, hepcidin, lipokalin-2 a beta-defenziny v plazmě, sputu a supernatantu kultur. Peptidové knihovny podporují screening vztahů struktura–aktivita, což je hlavní cesta k navrženým analogům AMP.

Jak laboratoře vybírají v rámci rodiny

Na prvním místě je druh, a to přísněji než u jiných témat. LL-37 a CRAMP nejsou zaměnitelné a použití lidského peptidu v myším modelu je uznávaným zdrojem neinterpretovatelných výsledků. Na druhém místě je oxidační stav: defenziny vyžadují správné párování disulfidových můstků a katalogová položka by měla uvádět, zda se peptid dodává oxidovaný a složený, nebo v lineární formě. Na třetím místě je protiion, a to je úskalí specifické pro AMP: zbytková TFA ze syntézy je sama o sobě antimikrobiální a cytotoxická při koncentracích používaných v testech AMP, takže pro práci s MIC a testy viability je standardem materiál s výměnou za acetát. Na čtvrtém místě je čistota a obsah: AMP uváděný s čistotou 95 % může po započtení soli a vody obsahovat hmotnostně podstatně méně než 95 % peptidu, což posouvá každou hodnotu MIC, kterou uvádíte. Průvodce COA vysvětluje rozdíl mezi obsahem peptidu a hrubou hmotností.

Poznámky k zacházení pro toto téma

Kationtové peptidy silně adsorbují na polystyren a plastové špičky a ztráty při nízkých mikromolárních koncentracích jsou dost velké na to, aby posunuly MIC o jedno ředění nebo více – používejte polypropylen, špičky s nízkou vazbou nebo nosič, jako je 0.01% kyselina octová s BSA, pokud to test toleruje. Záleží na složení média: standardní Mueller-Hintonův bujón s upraveným obsahem kationtů potlačuje aktivitu AMP ve srovnání s médii s nízkým obsahem solí, a proto práce o AMP specifikují médium tak pečlivě. Mimo to platí obvyklé zásady – uzavřené lahvičky s lyofilizátem při −20 °C, jednorázové alikvoty, minimum cyklů zmrazení a rozmrazení a pozornost věnovaná rozpustnosti u hydrofobních sekvencí (rozpustnost peptidů, průvodce skladováním, průvodce alikvotováním).

Kam dál

Projděte si kompletní antimikrobiální téma, rozcestník imunitního systému nebo rozcestník kůže, kde se studuje většina exprese lidských AMP. Související průvodci pokrývají průvodce typem výzkumné peptidy pro čtení specifikací a sekci rakoviny, která sdílí rodiny chemokinů.