Investigación con péptidos antimicrobianos: guía del catálogo de investigación

La investigación de péptidos antimicrobianos sigue una lógica distinta de la farmacología de receptores que rige la mayor parte de este catálogo. Los péptidos antimicrobianos (AMP) suelen ser catiónicos y anfipáticos, y su principal mecanismo descrito es físico —reparto en las membranas bacterianas aniónicas y permeabilización de estas— más que la unión a un receptor definido. Nuestra página temática antimicrobiana reúne los patrones peptídicos, antisueros y kits de inmunoensayo utilizados en esa literatura, desde los péptidos de defensa del huésped humanos hasta los AMP de insectos y anfibios. Esta guía cartografía las familias, los formatos y la manipulación específica de los ensayos que exige el trabajo con AMP.

Qué incluye la temática antimicrobiana

Una familia se clasifica aquí cuando su péptido de origen tiene actividad antibacteriana, antifúngica o antivírica documentada, o cuando forma parte de la defensa inmunitaria innata. Esto incluye las dos familias humanas clásicas —catelicidinas y defensinas—, además de AMP específicos de tejido, péptidos de secuestro de hierro, péptidos de invertebrados y anfibios utilizados como modelos mecanísticos, y los agonistas de receptores que vinculan los AMP con la señalización inflamatoria. Muchos de estos péptidos son también inmunomoduladores, por lo que la temática se solapa con la investigación inmunitaria en general. Todos los artículos se suministran exclusivamente para investigación in vitro y en animales autorizada; nada de lo que aquí figura es un producto antiinfeccioso.

Familias humanas de defensa del huésped

• LL-37: la única catelicidina humana, los 37 residuos C-terminales de hCAP18. Es el AMP más solicitado del catálogo, estudiado por su actividad sobre membranas, la neutralización del LPS, la quimiotaxis a través de FPR2 y la señalización de reparación de heridas. Se disponen de variantes truncadas y aleatorizadas como controles mecanísticos.
• Defensinas: α-defensinas (HNP-1 a HNP-4, HD-5, HD-6) y β-defensinas (hBD-1 a hBD-4), que se distinguen por su conectividad de disulfuros. Los tres puentes disulfuro son requisitos estructurales, por lo que las formas oxidadas y linealizadas son reactivos realmente distintos.
• Dermcidina: un AMP aniónico del sudor ecrino, una excepción ilustrativa a la regla catiónica y un comparador habitual en los estudios de mecanismo.
• Péptidos LEAP: péptidos antimicrobianos expresados en el hígado, incluida la hepcidina (LEAP-1), que se sitúa en la intersección entre la defensa antimicrobiana y la regulación del hierro y se mide en muchísimos estudios de fenotipado.
• Lipocalina-2 (NGAL): una proteína secuestradora de sideróforos que priva a las bacterias de hierro; un reactivo de inmunidad nutricional más que lítico de membranas.
• Intelectina: una lectina que se une a glucanos microbianos, solicitada para estudios de reconocimiento de patrones.
• Factor antisecretor: estudiado en la secreción de líquido entérico y en modelos de enfermedad inflamatoria intestinal.

Familias de AMP modelo y de comparación

• CRAMP: el ortólogo murino de la catelicidina LL-37. Cualquier estudio murino de la biología de la catelicidina necesita CRAMP, no LL-37: las secuencias difieren sustancialmente y la actividad no es trasladable.
• Apidecina: un AMP de insecto rico en prolina que actúa intracelularmente sobre el ribosoma y no por lisis, y por tanto el comparador estándar para distinguir los mecanismos líticos de los no líticos.
• Bombinaquinina: péptidos de la piel de anfibios del género Bombina, una fuente rica tanto de AMP como de péptidos relacionados con la bradicinina.
• AMP-IBP5: un péptido antimicrobiano derivado de la proteína 5 de unión a IGF, un ejemplo de actividad AMP que surge de un fragmento de una proteína no inmunitaria.

Compañeros de señalización inmunitaria innata

• fMLF (fMLP) y WKYMVm: agonistas de receptores de péptidos formilados utilizados como controles de quimiotaxis de neutrófilos, y ligandos de referencia estándar para comprobar si un AMP actúa a través de FPR1 o FPR2.
• Reactivos relacionados con el peptidoglucano: componentes de la pared celular bacteriana utilizados como estímulos de receptores de reconocimiento de patrones junto con el trabajo con AMP.
• Ac2-26: el péptido de la anexina A1, un agonista prorresolutivo de FPR2 que se combina con frecuencia con estudios de LL-37 porque ambos convergen en el mismo receptor.
• Familias de interleucinas y CXCL: varias quimiocinas tienen actividad antimicrobiana directa, y las lecturas de citocinas son la medición posterior habitual en los estudios de inmunomodulación por AMP.

Qué formatos incluye la temática antimicrobiana

Los patrones peptídicos sintéticos son el núcleo de esta temática y se solicitan a mayor escala que en otras, porque los ensayos de concentración mínima inhibitoria consumen material: los llenados de miligramos son la norma y no la excepción. Los péptidos marcados son importantes para el mecanismo: los AMP con marcaje fluorescente se utilizan para la microscopía de localización en la membrana bacteriana, y las versiones biotiniladas para la precipitación por afinidad de compañeros de unión. Los antisueros policlonales permiten la detección tisular de la expresión endógena de AMP, que es como la mayoría de los artículos sobre defensa del huésped demuestran la inducción. Los kits ELISA cuantifican LL-37, hepcidina, lipocalina-2 y beta-defensinas en plasma, esputo y sobrenadante de cultivo. Las bibliotecas de péptidos permiten el cribado de estructura-actividad, que es la vía principal hacia los análogos de AMP diseñados.

Cómo eligen los laboratorios dentro de una familia

En primer lugar la especie, y con más rigor que en otras temáticas. LL-37 y CRAMP no son intercambiables, y utilizar el péptido humano en un modelo murino es una fuente reconocida de resultados ininterpretables. En segundo lugar, el estado de oxidación: las defensinas requieren un emparejamiento correcto de puentes disulfuro, y una entrada de catálogo debe indicar si el péptido se suministra oxidado y plegado o en forma lineal. En tercer lugar el contraión, y esta es la trampa específica de los AMP: el TFA residual de la síntesis es en sí mismo antimicrobiano y citotóxico a las concentraciones que utilizan los ensayos de AMP, por lo que el material con intercambio a acetato es el estándar para el trabajo de CMI y viabilidad celular. En cuarto lugar, pureza y contenido: un AMP con una pureza declarada del 95 % puede contener bastante menos del 95 % de péptido en masa una vez contabilizadas la sal y el agua, lo que desplaza todos los valores de CMI que comunique. La guía del COA explica el contenido peptídico frente al peso bruto.

Notas de manipulación para esta temática

Los péptidos catiónicos se adsorben con fuerza al poliestireno y a las puntas de plástico, y las pérdidas a concentraciones micromolares bajas son lo bastante grandes como para desplazar una CMI una dilución o más: utilice polipropileno, puntas de baja unión o un portador como ácido acético al 0.01 % con BSA cuando el ensayo lo tolere. La composición del medio importa: el caldo Mueller-Hinton estándar ajustado en cationes suprime la actividad de los AMP en comparación con los medios con bajo contenido en sal, razón por la cual los artículos sobre AMP especifican el medio con tanto cuidado. Por lo demás, se aplica lo habitual: viales liofilizados sellados a −20 °C, alícuotas de un solo uso, mínima congelación-descongelación y atención a la solubilidad de las secuencias hidrófobas (solubilidad de los péptidos, guía de almacenamiento, guía de preparación de alícuotas).

Siguientes pasos

Explore la temática antimicrobiana completa, el portal del sistema inmunitario o el portal de la piel, donde se estudia la mayor parte de la expresión humana de AMP. Otras guías relacionadas tratan la guía por tipo de péptidos de investigación, para la lectura de especificaciones, y la sección de cáncer, que comparte las familias de quimiocinas.