Ricerca sui peptidi antimicrobici: guida al catalogo di ricerca

La ricerca sui peptidi antimicrobici segue una logica diversa dalla farmacologia recettoriale che governa la maggior parte di questo catalogo. I peptidi antimicrobici (AMP) sono tipicamente cationici e anfipatici, e il loro principale meccanismo descritto è fisico — ripartizione nelle membrane batteriche anioniche e loro permeabilizzazione — piuttosto che il legame a un recettore definito. La nostra pagina tematica sugli antimicrobici raccoglie gli standard peptidici, gli antisieri e i kit immunologici usati in questa letteratura, dai peptidi di difesa dell'ospite umani agli AMP di insetti e anfibi. Questa guida mappa le famiglie, i formati e la manipolazione specifica per i saggi che il lavoro sugli AMP richiede.

Che cosa rientra nel tema antimicrobici

Una famiglia è classificata qui quando il peptide di origine ha un'attività antibatterica, antifungina o antivirale documentata, o quando svolge un ruolo nella difesa immunitaria innata. Ciò include le due famiglie umane classiche — catelicidine e defensine — oltre agli AMP tessuto-specifici, ai peptidi che sottraggono ferro, ai peptidi di invertebrati e anfibi usati come modelli meccanicistici e agli agonisti recettoriali che collegano gli AMP alla segnalazione infiammatoria. Molti di questi peptidi sono anche immunomodulatori, per cui il tema si sovrappone in generale alla ricerca immunologica. Ogni articolo è fornito esclusivamente per la ricerca in vitro e su modelli animali approvati; nulla di quanto qui presente è un prodotto anti-infettivo.

Famiglie umane di difesa dell'ospite

• LL-37 — l'unica catelicidina umana, corrispondente ai 37 residui C-terminali di hCAP18. È l'AMP più richiesto del catalogo, studiato per l'attività di membrana, la neutralizzazione dell'LPS, la chemiotassi tramite FPR2 e la segnalazione di riparazione tissutale. Varianti troncate e scrambled sono disponibili come controlli meccanicistici.
• Defensine — α-defensine (da HNP-1 a HNP-4, HD-5, HD-6) e β-defensine (da hBD-1 a hBD-4), distinte in base alla connettività dei ponti disolfuro. I tre ponti disolfuro sono requisiti strutturali, quindi le forme ossidate e quelle linearizzate sono reagenti realmente diversi.
• Dermcidina — un AMP anionico del sudore eccrino, un'eccezione istruttiva alla regola cationica e un comune termine di confronto negli studi sui meccanismi.
• Peptidi LEAP — peptidi antimicrobici espressi dal fegato, tra cui l'epcidina (LEAP-1), che si colloca all'incrocio tra difesa antimicrobica e regolazione del ferro ed è misurata in moltissimi studi di fenotipizzazione.
• Lipocalina-2 (NGAL) — una proteina che sequestra i siderofori e priva i batteri del ferro; un reagente di immunità nutrizionale più che litico sulle membrane.
• Intelectina — una lectina che lega i glicani microbici, richiesta per gli studi di riconoscimento dei pattern.
• Fattore antisecretorio — studiato nella secrezione di fluidi enterici e nei modelli di malattia infiammatoria intestinale.

Famiglie di AMP modello e di confronto

• CRAMP — l'ortologo murino di LL-37 tra le catelicidine. Qualsiasi studio murino sulla biologia delle catelicidine richiede CRAMP, non LL-37: le sequenze differiscono in modo sostanziale e l'attività non è trasferibile.
• Apidecina — un AMP di insetto ricco di prolina che agisce a livello intracellulare sul ribosoma anziché per lisi, e quindi il confronto standard per distinguere i meccanismi litici da quelli non litici.
• Bombinachinina — peptidi della pelle di anfibi del genere Bombina, fonte ricca sia di AMP sia di peptidi correlati alla bradichinina.
• AMP-IBP5 — un peptide antimicrobico derivato dalla proteina legante IGF 5, esempio di attività AMP che emerge da un frammento di una proteina non immunitaria.

Reagenti complementari di segnalazione immunitaria innata

• fMLF (fMLP) e WKYMVm — agonisti dei recettori per i peptidi formilati, usati come controlli di chemiotassi dei neutrofili e come ligandi di riferimento standard per verificare se un AMP agisce tramite FPR1 o FPR2.
• Reagenti correlati al peptidoglicano — componenti della parete cellulare batterica usati come stimoli dei recettori di riconoscimento dei pattern accanto al lavoro sugli AMP.
• Ac2-26 — il peptide dell'annessina A1, un agonista FPR2 pro-risolutivo spesso abbinato agli studi su LL-37 perché entrambi convergono sullo stesso recettore.
• Famiglie delle interleuchine e CXCL — diverse chemochine hanno attività antimicrobica diretta, e le letture delle citochine sono la consueta misura a valle negli studi di immunomodulazione degli AMP.

Quali formati comprende il tema antimicrobici

Gli standard peptidici sintetici sono il nucleo di questo tema e vengono ordinati in quantità maggiori che altrove, perché i saggi di concentrazione minima inibente consumano materiale: i riempimenti in milligrammi sono la norma e non l'eccezione. I peptidi marcati sono importanti per lo studio dei meccanismi: gli AMP con marcatura fluorescente servono alla microscopia di localizzazione sulle membrane batteriche, le versioni biotinilate al pull-down dei partner di legame. Gli antisieri policlonali supportano la rilevazione tissutale dell'espressione endogena degli AMP, che è il modo in cui la maggior parte degli articoli sulla difesa dell'ospite ne dimostra l'induzione. I kit ELISA quantificano LL-37, epcidina, lipocalina-2 e beta-defensine in plasma, espettorato e surnatante di coltura. Le librerie peptidiche supportano lo screening struttura–attività, principale via verso analoghi di AMP progettati.

Come i laboratori scelgono all'interno di una famiglia

Prima la specie, e con più rigore che negli altri temi. LL-37 e CRAMP non sono intercambiabili, e usare il peptide umano in un modello murino è una fonte riconosciuta di risultati non interpretabili. In secondo luogo lo stato di ossidazione: le defensine richiedono il corretto appaiamento dei ponti disolfuro, e una voce di catalogo deve indicare se il peptide è fornito ossidato e ripiegato oppure in forma lineare. In terzo luogo il controione, che è l'insidia specifica degli AMP: il TFA residuo della sintesi è a sua volta antimicrobico e citotossico alle concentrazioni usate nei saggi sugli AMP, per cui il materiale con scambio ad acetato è lo standard per i lavori su MIC e vitalità cellulare. In quarto luogo purezza e contenuto: un AMP dichiarato al 95% di purezza può contenere in massa sensibilmente meno del 95% di peptide una volta considerati sale e acqua, il che sposta ogni valore di MIC riportato. La guida al COA spiega il contenuto peptidico rispetto al peso lordo.

Note di manipolazione per questo tema

I peptidi cationici si adsorbono fortemente al polistirene e ai puntali di plastica, e le perdite a basse concentrazioni micromolari sono abbastanza grandi da spostare una MIC di una o più diluizioni: usare polipropilene, puntali a basso legame o un carrier come acido acetico allo 0.01% con BSA, dove il saggio lo tollera. La composizione del terreno conta: il brodo Mueller-Hinton standard corretto per i cationi sopprime l'attività degli AMP rispetto ai terreni a basso contenuto salino, motivo per cui gli articoli sugli AMP specificano il terreno con tanta cura. Per il resto valgono le regole consuete — flaconcini liofilizzati sigillati a −20 °C, aliquote monouso, cicli di congelamento–scongelamento ridotti al minimo e attenzione alla solubilità delle sequenze idrofobiche (solubilità dei peptidi, guida alla conservazione, guida all'aliquotazione).

Dove proseguire

Consulti l'intero tema antimicrobici, l'hub sul sistema immunitario o l'hub sulla pelle, dove si studia la maggior parte dell'espressione degli AMP umani. Guide correlate trattano la guida al tipo peptidi di ricerca per la lettura delle specifiche e la sezione sul cancro, che condivide le famiglie delle chemochine.