Glosář
Biotinová značka
Biotinylace dává peptidu femtomolární úchyt pro záchyt streptavidinem. Délka spaceru, endogenní biotin a limity eluce vysvětleny.
Biotinová značka je molekula biotinu (vitaminu B7) konjugovaná k peptidu, obvykle na N-konci nebo na postranním řetězci lysinu. Její hodnota spočívá v interakci se streptavidinem: disociační konstanta ve femtomolárním rozsahu, jedna z nejsilnějších nekovalentních vazeb v biologii, stabilní vůči detergentům, vysoké koncentraci solí a středně silným denaturačním činidlům.
Jak se používá a co ji omezuje
Biotinylované peptidy jsou standardním nástrojem pro pull-down a identifikaci cílů na streptavidinových magnetických kuličkách, pro imobilizaci na ELISA destičkách a SPR čipech potažených streptavidinem a pro zesílenou detekci, kde konjugát streptavidin-HRP nahrazuje značenou sekundární protilátku.
Opakovaně se objevují tři praktická omezení. Za prvé délka spaceru: valerový konec biotinu je krátký a vazebná kapsa hluboká, takže se obvykle vkládá linker z kyseliny aminohexanové nebo PEG, aby peptid zůstal přístupný. Za druhé endogenní biotin: tkáně jako játra, ledviny a mozek obsahují tolik volného biotinu, že konkuruje, což vyžaduje krok blokování avidinem/biotinem. Za třetí eluce: interakce je tak silná, že získání intaktních komplexů obecně vyžaduje var v SDS, nadbytek volného biotinu při dlouhé inkubaci nebo štěpitelný linker navržený od samého začátku.
Související pojmy a materiály
značka FAM/FITC · I-125 radioaktivní značka · čistota. Referenční materiál: značené peptidy, značené protilátky. Další čtení: průvodce značenými peptidy.