Wat is IGF-1 LR3? Structuur, IGF-1R-mechanisme en onderzoeksoverzicht

IGF-1 LR3 is een recombinant analoog van 83 residuen van humane insulineachtige groeifactor 1, met twee bewuste wijzigingen: een arginine in plaats van glutamaat op positie 3, en een verlenging van 13 residuen aan de N-terminus. Beide modificaties hebben één doel — het molecuul zijn affiniteit ontnemen voor de IGF-bindende eiwitten die natief IGF-1 normaal gesproken wegvangen — terwijl de affiniteit voor de IGF-1-receptor in wezen intact blijft. Het resultaat is een groeifactor die vrij blijft in oplossing en in serumhoudende kweek, en daarom werd het een standaardreagens in celkweek- en receptorsignaleringsonderzoek, lang voordat het in catalogi voor onderzoekschemicaliën verscheen.

Peptide Medix EU levert IGF-1 LR3 als gevriesdroogd poeder in flacons van 0,1 mg en 1 mg binnen het assortiment IGF- en spierpeptiden.

Wat is IGF-1 LR3?

De naam beschrijft de chemie. „LR3” staat voor Long R3: Long voor de N-terminale verlenging, R3 voor de arginine op residu 3. Het moedermolecuul, IGF-1, is een enkelketenig eiwit van 70 aminozuren dat structureel verwant is aan pro-insuline, grotendeels in de lever wordt aangemaakt onder invloed van groeihormoon en werkt op de IGF-1-receptor, een receptortyrosinekinase. Natief IGF-1 circuleert vrijwel volledig gebonden aan een familie van zes IGF-bindende eiwitten, die de beschikbaarheid ervan reguleren en de vrije halfwaardetijd terugbrengen tot enkele minuten.

IGF-1 LR3 wordt geproduceerd via recombinante expressie en niet via vastefasesynthese — met 83 residuen en 9.117,60 g/mol is het een klein eiwit, geen peptide dat in de praktijk stapsgewijs kan worden opgebouwd. Het heeft CAS-nummer 946870-92-4 en de molecuulformule C400H625N111O115S9, met de drie disulfidebruggen van de natieve IGF-1-vouwing.

Oorsprong en structuur

Beide modificaties richten zich op het contact met de bindende eiwitten, niet op het receptorcontact. Glutamaat 3 bevindt zich in het N-terminale gebied van IGF-1 dat een belangrijk elektrostatisch contact met de bindende eiwitten maakt; vervanging door arginine keert de lokale lading om en zou de IGFBP-affiniteit met ongeveer twee ordegroottes verlagen. De verlenging van 13 residuen (MFPAMPLSSLFVN) voegt extra sterische hinder toe op hetzelfde grensvlak en verhoogt bovendien het iso-elektrisch punt van het molecuul, wat de hanteringseigenschappen in oplossing verandert.

Wat de modificaties bewust ongemoeid laten, is het receptorbindende oppervlak. De residuen die contact maken met IGF-1R liggen elders in de vouwing, zodat IGF-1 LR3 een volledige agonist aan de receptor blijft. Het gevolg, consistent gerapporteerd in kweeksystemen, is een aanzienlijk hogere schijnbare potentie dan natief IGF-1 — niet omdat het analoog sterker aan de receptor bindt, maar omdat veel meer ervan vrij is om dat te doen.

Hoe IGF-1 LR3 vermoedelijk werkt

IGF-1 LR3 bindt aan de IGF-1-receptor, een via disulfidebruggen gekoppeld α2β2-tyrosinekinase dat nauw verwant is aan de insulinereceptor. Ligandbinding leidt tot autofosforylering van het kinasedomein van de β-subeenheid en rekrutering van insulinereceptorsubstraateiwitten, die zich vertakken in twee hoofdroutes: PI3K/Akt/mTOR, in de literatuur geassocieerd met uitleesparameters voor eiwitsynthese en celoverleving, en Ras/Raf/MEK/ERK, geassocieerd met proliferatieparameters. In myoblastsystemen zijn dit de routes die onderzoekers bemonsteren wanneer zij de respons meten.

Twee mechanistische kanttekeningen zijn van belang voor de proefopzet. Ten eerste vormen IGF-1R en de insulinereceptor hybride receptoren, en IGF-1-analogen behouden een meetbare affiniteit voor isovorm A van de insulinereceptor; selectiviteit is relatief, niet absoluut. Ten tweede verwijdert het analoog, doordat het aan de controle door bindende eiwitten ontsnapt, een regulerende laag die deel uitmaakt van de natieve IGF-1-biologie. Een studie met IGF-1 LR3 meet bewust ongebufferde receptoractivatie, wat nuttig is voor signaleringsvragen, maar minder representatief voor fysiologische IGF-1-blootstelling.

Wat het onderzoek heeft onderzocht

Celkweek en bioprocessing

De grootste en best gevestigde toepassing is als supplement voor serumvrij medium. Long R3 IGF-1 wordt in de biotechnologische literatuur veelvuldig beschreven als vervanger van insuline in CHO- en hybridomakweken, waar de resistentie tegen bindende eiwitten die de cellen zelf uitscheiden het een langere functionele levensduur in het medium geeft dan natief IGF-1. Dit is in-vitrowerk op industriële schaal met goed gekarakteriseerde resultaten.

Signalering in myoblasten en skeletspier

Studies met C2C12- en primaire myoblasten hebben IGF-1 LR3 gebruikt om proliferatie en differentiatie, Akt-fosforylering en hypertrofische signalering in gekweekte myotubes te onderzoeken. Dit zijn uitleesparameters op celniveau; extrapolatie daarvan naar uitkomsten op het niveau van het hele organisme wordt door de gepubliceerde gegevens niet ondersteund.

Groei- en metabole modellen bij knaagdieren

Dierexperimenteel werk met Long R3 IGF-1 dateert grotendeels uit de jaren negentig, waaronder studies bij ratten die een grotere groeibevorderende potentie rapporteerden dan equimolair natief IGF-1, in overeenstemming met de redenering rond de bindende eiwitten. Metabole studies hebben ook hypoglykemische responsen gerapporteerd, die de hierboven genoemde resterende kruisreactiviteit met de insulinereceptor weerspiegelen.

Vergelijkend onderzoek met analogen

IGF-1 LR3 wordt vaak onderzocht naast IGF-1 DES (1-3), het ingekorte analoog dat hetzelfde probleem met de bindende eiwitten oplost via deletie in plaats van substitutie. De twee gedragen zich verschillend in weefsels waar IGFBP-proteolyse actief is, en de keuze tussen beide is een echte experimentele beslissing en geen voorkeurskwestie — uiteengezet in onze vergelijking IGF-1 LR3 vs IGF-1 DES en in het achtergrondartikel over waarom deze modificaties bestaan.

Vormen en verpakkingen die wij leveren

De flacon van 0,1 mg is geschikt voor kweekwerk op één plaat en receptorassays waarbij de werkconcentratie in het bereik van nanogrammen per milliliter ligt; de flacon van 1 mg is de eenheid voor langere reeksen die van begin tot eind één lot vereisen. Controles bij de inkoop worden behandeld in onze koopgids voor IGF-1 LR3.

Reconstitutie en opslag in een laboratoriumcontext

Recombinante groeifactoren worden anders gehanteerd dan kleine synthetische peptiden. IGF-1 LR3 is slecht oplosbaar bij neutrale pH, en in gepubliceerde productdocumentatie wordt het gereconstitueerd in een verdund zuur — gewoonlijk 10 mM zoutzuur of 0,1% azijnzuur — voordat het in buffer of medium wordt verdund. Direct reconstitueren in een neutrale buffer brengt het risico van onvolledig oplossen en aggregatie met zich mee, wat zich uit als inconsistente activiteit in plaats van als zichtbaar neerslag.

De berekening is eenvoudig: een flacon van 1 mg aangevuld tot 1 mL levert 1 mg/mL op, oftewel 1.000 mcg/mL; 0,1 mL bevat 100 mcg. Werkvoorraden voor kweek liggen doorgaans enkele verdunningsstappen lager. Verdunde oplossingen van elk eiwit verliezen materiaal aan kunststof- en glasoppervlakken, dus een dragereiwit zoals 0,1% runderserumalbumine is standaardpraktijk voor werkvoorraden onder ongeveer 10 mcg/mL. De algemene methode staat in onze reconstitutiegids.

Gevriesdroogde flacons worden bewaard bij −20 °C of lager, afgesloten en beschermd tegen licht en vocht. Gereconstitueerd materiaal wordt direct in aliquots verdeeld en ingevroren; herhaald invriezen en ontdooien is de meest voorkomende oorzaak van activiteitsverlies bij een eiwit van 9 kDa met drie disulfidebruggen. Uitgebreidere richtlijnen staan in hoe u peptiden bewaart.

Zuiverheid, COA en hoe u het leest

Certificaten voor een recombinant eiwit hebben een ander gewicht dan die voor een synthetisch peptide. De HPLC-zuiverheid blijft het hoofdcijfer, maar voor een product van 83 residuen zijn de informatievere onderdelen het massaspectrometrieresultaat, dat moet overeenkomen met 9.117,60 g/mol en zo het LR3-analoog onderscheidt van natief IGF-1 met 7.649 g/mol, en een eventuele SDS-PAGE-afbeelding, die aggregatie- en truncatieproducten zichtbaar maakt die een reversed-phase-chromatogram kan verbergen. Het endotoxinegehalte is ook relevant voor gebruik in celkweek, aangezien bacteriële expressiesystemen de gebruikelijke bron zijn. Onze gids over het lezen van een analysecertificaat voor peptiden legt uit hoe deze onderdelen samenhangen.

Regelgevende status

IGF-1 LR3 heeft in de Verenigde Staten geen handelsvergunning als geneesmiddel. Een verwant maar afzonderlijk molecuul, recombinant humaan IGF-1 (mecasermine), is een goedgekeurd receptgeneesmiddel voor een zeldzame groeistoornis; IGF-1 LR3 is niet dat molecuul en is er niet onderling uitwisselbaar mee. IGF-1 en zijn analogen zijn in de sport verboden onder de antidopingregels.

Verwante moleculen en verder lezen

De naaste verwanten zijn IGF-1 DES (1-3), het op truncatie gebaseerde analoog, en MGF, het E-domeinpeptide uit de IGF-1 Ec-splicevariant, dat helemaal geen receptoragonist is en een andere vraag beantwoordt. Een bredere oriëntatie vindt u in ons overzicht van peptiden voor onderzoek naar spiergroei.