O que é o IGF-1 LR3? Estrutura, mecanismo IGF-1R e panorama da investigação

O IGF-1 LR3 é um análogo recombinante de 83 resíduos do fator de crescimento semelhante à insulina 1 humano, com duas alterações deliberadas: uma arginina em vez do glutamato na posição 3 e uma extensão de 13 resíduos acrescentada ao N-terminal. Ambas as modificações existem por uma razão — retirar à molécula a afinidade para as proteínas de ligação ao IGF que normalmente sequestram o IGF-1 nativo —, deixando essencialmente intacta a afinidade para o recetor do IGF-1. O resultado é um fator de crescimento que permanece livre em solução e em cultura com soro, razão pela qual se tornou um reagente padrão em trabalho de cultura celular e de sinalização de recetores muito antes de surgir nos catálogos de produtos químicos de investigação.

A Peptide Medix EU fornece o IGF-1 LR3 como pó liofilizado em frascos de 0,1 mg e 1 mg, na gama de péptidos IGF e musculares.

O que é o IGF-1 LR3?

O nome codifica a química. «LR3» significa Long R3: «Long» pela extensão N-terminal, «R3» pela arginina no resíduo 3. A molécula de origem, o IGF-1, é uma proteína de cadeia única com 70 aminoácidos, estruturalmente relacionada com a pró-insulina, produzida em grande parte no fígado sob controlo da hormona de crescimento e que atua no recetor do IGF-1, um recetor tirosina cinase. O IGF-1 nativo circula quase inteiramente ligado a uma família de seis proteínas de ligação ao IGF, que controlam a sua disponibilidade e encurtam a sua semivida livre para alguns minutos.

O IGF-1 LR3 é produzido por expressão recombinante e não por síntese em fase sólida — com 83 resíduos e 9117,60 g/mol, é uma proteína pequena e não um péptido que pudesse ser montado passo a passo de forma prática. Tem o número CAS 946870-92-4 e a fórmula molecular C400H625N111O115S9, com as três pontes dissulfureto da dobragem nativa do IGF-1.

Origem e estrutura

Ambas as modificações visam o contacto com as proteínas de ligação e não o contacto com o recetor. O glutamato 3 situa-se na região N-terminal do IGF-1 que estabelece um contacto eletrostático fundamental com as proteínas de ligação; substituí-lo por arginina inverte a carga local e foi descrito como reduzindo a afinidade para as IGFBP em cerca de duas ordens de grandeza. A extensão de 13 resíduos (MFPAMPLSSLFVN) acrescenta mais interferência estérica na mesma interface e aumenta também o ponto isoelétrico da molécula, o que altera as suas características de manuseamento em solução.

O que as modificações deixam deliberadamente intacto é a superfície de ligação ao recetor. Os resíduos que contactam o IGF-1R situam-se noutra zona da dobragem, pelo que o IGF-1 LR3 continua a ser um agonista total do recetor. A consequência, descrita de forma consistente em sistemas de cultura, é uma potência aparente substancialmente maior do que a do IGF-1 nativo — não porque o análogo se ligue ao recetor com mais força, mas porque muito mais dele está livre para o fazer.

Como se pensa que o IGF-1 LR3 atua

O IGF-1 LR3 liga-se ao recetor do IGF-1, uma tirosina cinase α2β2 ligada por dissulfuretos e estreitamente relacionada com o recetor da insulina. A ligação do ligando desencadeia a autofosforilação do domínio cinase da subunidade β e o recrutamento de proteínas do substrato do recetor da insulina, que se ramificam em duas vias principais: PI3K/Akt/mTOR, associada na literatura a resultados de síntese proteica e sobrevivência celular, e Ras/Raf/MEK/ERK, associada a resultados de proliferação. Em sistemas de mioblastos, são estas as vias que os investigadores avaliam ao medir a resposta.

Há duas ressalvas mecanísticas relevantes para o desenho experimental. Primeiro, o IGF-1R e o recetor da insulina formam recetores híbridos, e os análogos do IGF-1 mantêm uma afinidade mensurável para a isoforma A do recetor da insulina; a seletividade é relativa, não absoluta. Segundo, ao escapar ao controlo das proteínas de ligação, o análogo elimina uma camada reguladora que faz parte da biologia nativa do IGF-1. Um estudo que utilize o IGF-1 LR3 está deliberadamente a medir a ativação do recetor sem tamponamento, o que é útil para questões de sinalização e menos representativo da exposição fisiológica ao IGF-1.

O que a investigação examinou

Cultura celular e bioprocessamento

A utilização mais extensa e mais bem estabelecida é como suplemento de meio sem soro. O Long R3 IGF-1 é amplamente descrito na literatura de biotecnologia como substituto da insulina em culturas de CHO e de hibridomas, onde a sua resistência às proteínas de ligação secretadas pelas próprias células lhe confere uma vida funcional mais longa no meio do que a do IGF-1 nativo. Trata-se de trabalho in vitro, à escala industrial, com resultados bem caracterizados.

Sinalização em mioblastos e músculo esquelético

Estudos com C2C12 e mioblastos primários utilizaram o IGF-1 LR3 para examinar a proliferação e a diferenciação, a fosforilação da Akt e a sinalização hipertrófica em miotubos em cultura. São resultados ao nível celular; a extrapolação a partir deles para resultados no organismo inteiro não é suportada pelo registo publicado.

Modelos de crescimento e metabólicos em roedores

O trabalho em animais com Long R3 IGF-1 data em grande parte da década de 1990 e inclui estudos em ratos que descrevem maior potência promotora do crescimento do que o IGF-1 nativo em quantidade equimolar, coerente com a lógica das proteínas de ligação. Estudos metabólicos descreveram também respostas hipoglicemiantes, refletindo a reatividade cruzada residual com o recetor da insulina acima referida.

Trabalho comparativo com análogos

O IGF-1 LR3 é frequentemente estudado a par do IGF-1 DES (1-3), o análogo truncado que resolve o mesmo problema das proteínas de ligação por deleção em vez de substituição. Os dois comportam-se de forma diferente em tecidos com proteólise ativa das IGFBP, e a escolha entre eles é uma verdadeira decisão experimental e não uma preferência — apresentada na nossa comparação entre IGF-1 LR3 e IGF-1 DES e no artigo de enquadramento sobre a razão de ser destas modificações.

Formas e formatos fornecidos

O frasco de 0,1 mg adequa-se a trabalho de cultura numa única placa e a ensaios de recetores em que a concentração de trabalho se situa na gama de nanogramas por mililitro; o frasco de 1 mg é a unidade para séries prolongadas que necessitam de um único lote do princípio ao fim. As verificações de aquisição são abordadas no nosso guia de compra do IGF-1 LR3.

Reconstituição e armazenamento em contexto laboratorial

Os fatores de crescimento recombinantes são manuseados de forma diferente dos péptidos sintéticos pequenos. O IGF-1 LR3 é pouco solúvel a pH neutro, e a literatura publicada do produto reconstitui-o num ácido diluído — habitualmente ácido clorídrico 10 mM ou ácido acético a 0,1% — antes de o diluir em tampão ou meio. Reconstituí-lo diretamente num tampão neutro arrisca uma dissolução incompleta e agregação, que se manifesta como atividade inconsistente e não como precipitado visível.

A aritmética é simples: um frasco de 1 mg perfeito a 1 mL dá 1 mg/mL, ou 1000 mcg/mL; 0,1 mL contêm 100 mcg. As soluções de trabalho para cultura estão habitualmente várias diluições abaixo disso. As soluções diluídas de qualquer proteína perdem material para as superfícies de plástico e de vidro, pelo que uma proteína transportadora, como a albumina sérica bovina a 0,1%, é prática corrente em soluções de trabalho abaixo de cerca de 10 mcg/mL. O método geral está no nosso guia de reconstituição.

Os frascos liofilizados são mantidos a −20 °C ou menos, selados e protegidos da luz e da humidade. O material reconstituído é dividido em alíquotas de imediato e congelado; a congelação e descongelação repetidas são a causa mais comum de perda de atividade numa proteína de 9 kDa com três pontes dissulfureto. Orientações mais amplas estão em «Como armazenar péptidos».

Pureza, COA e como o ler

Os certificados de uma proteína recombinante têm um peso diferente dos de um péptido sintético. A pureza por HPLC continua a ser o valor principal, mas, para um produto de 83 resíduos, os elementos mais informativos são o resultado de espectrometria de massa, que deve corresponder a 9117,60 g/mol e assim distinguir o análogo LR3 do IGF-1 nativo, com 7649 g/mol, e qualquer imagem de SDS-PAGE, que revela produtos de agregação e de truncagem que um traçado de fase reversa pode ocultar. O teor de endotoxinas é também relevante para utilização em cultura celular, uma vez que os sistemas de expressão bacterianos são a fonte habitual. O nosso guia sobre como ler um certificado de análise de péptidos explica como estas secções se articulam.

Estatuto regulamentar

O IGF-1 LR3 não tem autorização de introdução no mercado como medicamento nos Estados Unidos. Uma molécula relacionada mas distinta, o IGF-1 humano recombinante (mecasermina), é um medicamento aprovado sujeito a receita médica para uma doença rara do crescimento; o IGF-1 LR3 não é essa molécula e não é intercambiável com ela. O IGF-1 e os seus análogos são proibidos no desporto ao abrigo das regras antidopagem.

Moléculas relacionadas e leituras adicionais

Os vizinhos mais próximos são o IGF-1 DES (1-3), o análogo baseado em truncagem, e o MGF, o péptido do domínio E da variante de splicing IGF-1 Ec, que não é de todo um agonista do recetor e responde a uma questão diferente. Uma orientação mais ampla encontra-se na nossa visão geral dos péptidos para investigação em crescimento muscular.