Che cos'è l'IGF-1 LR3? Struttura, meccanismo su IGF-1R e panoramica della ricerca

L'IGF-1 LR3 è un analogo ricombinante di 83 residui del fattore di crescita insulino-simile 1 umano, con due modifiche volute: un'arginina al posto del glutammato in posizione 3 e un'estensione di 13 residui aggiunta all'N-terminale. Entrambe le modifiche esistono per un unico motivo — privare la molecola dell'affinità per le proteine leganti l'IGF che normalmente sequestrano l'IGF-1 nativo — lasciando sostanzialmente intatta l'affinità per il recettore dell'IGF-1. Il risultato è un fattore di crescita che resta libero in soluzione e in coltura con siero, motivo per cui è diventato un reagente standard nel lavoro su colture cellulari e segnalazione recettoriale molto prima di comparire nei cataloghi di sostanze chimiche per la ricerca.

Peptide Medix EU fornisce IGF-1 LR3 come polvere liofilizzata in flaconcini da 0.1 mg e 1 mg all'interno della gamma di peptidi IGF e per la massa muscolare.

Che cos'è l'IGF-1 LR3?

Il nome codifica la chimica. "LR3" sta per Long R3: «Long» per l'estensione N-terminale, «R3» per l'arginina in posizione 3. La molecola madre, l'IGF-1, è una proteina a singola catena di 70 amminoacidi strutturalmente correlata alla proinsulina, prodotta in gran parte dal fegato sotto il controllo dell'ormone della crescita e attiva sul recettore dell'IGF-1, un recettore tirosin-chinasico. L'IGF-1 nativo circola quasi interamente legato a una famiglia di sei proteine leganti l'IGF, che ne controllano la disponibilità e ne riducono l'emivita libera a pochi minuti.

L'IGF-1 LR3 è prodotto per espressione ricombinante anziché per sintesi in fase solida: con 83 residui e 9,117.60 g/mol è una piccola proteina, non un peptide assemblabile in pratica passo dopo passo. Ha numero CAS 946870-92-4 e formula molecolare C400H625N111O115S9, con i tre ponti disolfuro del ripiegamento nativo dell'IGF-1.

Origine e struttura

Entrambe le modifiche riguardano il contatto con le proteine leganti anziché quello con il recettore. Il glutammato 3 si trova nella regione N-terminale dell'IGF-1 che stabilisce un contatto elettrostatico chiave con le proteine leganti; la sua sostituzione con arginina inverte la carica locale ed è stato riportato che riduce l'affinità per le IGFBP di circa due ordini di grandezza. L'estensione di 13 residui (MFPAMPLSSLFVN) aggiunge un ulteriore ingombro sterico sulla stessa interfaccia e innalza anche il punto isoelettrico della molecola, il che ne modifica le caratteristiche di manipolazione in soluzione.

Ciò che le modifiche lasciano deliberatamente intatto è la superficie di legame al recettore. I residui che contattano IGF-1R si trovano altrove nel ripiegamento, per cui l'IGF-1 LR3 resta un agonista pieno del recettore. La conseguenza, riportata in modo coerente nei sistemi in coltura, è una potenza apparente sostanzialmente maggiore rispetto all'IGF-1 nativo: non perché l'analogo leghi il recettore più saldamente, ma perché una quota molto maggiore è libera di farlo.

Come si ritiene che agisca l'IGF-1 LR3

L'IGF-1 LR3 lega il recettore dell'IGF-1, una tirosin-chinasi α2β2 legata da ponti disolfuro e strettamente correlata al recettore dell'insulina. Il legame del ligando innesca l'autofosforilazione del dominio chinasico della subunità β e il reclutamento delle proteine substrato del recettore dell'insulina, che si ramificano in due vie principali: PI3K/Akt/mTOR, associata in letteratura alle letture di sintesi proteica e sopravvivenza cellulare, e Ras/Raf/MEK/ERK, associata alle letture di proliferazione. Nei sistemi a mioblasti sono queste le vie che i ricercatori campionano quando misurano la risposta.

Due riserve meccanicistiche contano per il disegno sperimentale. In primo luogo, IGF-1R e il recettore dell'insulina formano recettori ibridi, e gli analoghi dell'IGF-1 mantengono un'affinità misurabile per l'isoforma A del recettore dell'insulina; la selettività è relativa, non assoluta. In secondo luogo, poiché l'analogo elude il controllo delle proteine leganti, rimuove un livello di regolazione che fa parte della biologia nativa dell'IGF-1. Uno studio che utilizza l'IGF-1 LR3 misura deliberatamente un'attivazione recettoriale non tamponata, utile per le domande di segnalazione e meno rappresentativa dell'esposizione fisiologica all'IGF-1.

Che cosa ha esaminato la ricerca

Colture cellulari e bioprocessi

L'impiego più ampio e consolidato è come integratore per terreni privi di siero. Long R3 IGF-1 è ampiamente riportato nella letteratura biotecnologica come sostituto dell'insulina nelle colture CHO e di ibridomi, dove la sua resistenza alle proteine leganti secrete dalle cellule stesse gli conferisce una vita funzionale nel terreno più lunga rispetto all'IGF-1 nativo. Si tratta di lavoro in vitro, su scala industriale, con risultati ben caratterizzati.

Segnalazione nei mioblasti e nel muscolo scheletrico

Studi su C2C12 e mioblasti primari hanno utilizzato l'IGF-1 LR3 per esaminare proliferazione e differenziamento, fosforilazione di Akt e segnalazione ipertrofica nei miotubi in coltura. Sono letture a livello cellulare; l'estrapolazione da esse a esiti nell'organismo intero non è supportata da quanto pubblicato.

Modelli di crescita e metabolici nei roditori

Il lavoro sugli animali con Long R3 IGF-1 risale in gran parte agli anni Novanta e comprende studi nei ratti che riportano una potenza di promozione della crescita maggiore rispetto all'IGF-1 nativo equimolare, coerentemente con il razionale sulle proteine leganti. Studi metabolici hanno inoltre riportato risposte ipoglicemizzanti, che riflettono la residua cross-reattività con il recettore dell'insulina indicata sopra.

Studi comparativi tra analoghi

L'IGF-1 LR3 è spesso studiato insieme all'IGF-1 DES (1-3), l'analogo troncato che risolve lo stesso problema delle proteine leganti per delezione anziché per sostituzione. I due si comportano diversamente nei tessuti in cui la proteolisi delle IGFBP è attiva, e la scelta tra essi è una reale decisione sperimentale anziché una preferenza: è illustrata nel nostro confronto IGF-1 LR3 vs IGF-1 DES e nell'approfondimento sul perché esistono queste modifiche.

Forme e formati forniti

Il flaconcino da 0.1 mg è adatto al lavoro su singola piastra e ai saggi recettoriali, dove la concentrazione di lavoro è nell'intervallo dei nanogrammi per millilitro; quello da 1 mg è l'unità per serie prolungate che richiedono un unico lotto per tutta la durata. Le verifiche di approvvigionamento sono trattate nella nostra guida all'acquisto dell'IGF-1 LR3.

Ricostituzione e conservazione in laboratorio

I fattori di crescita ricombinanti si manipolano diversamente dai piccoli peptidi sintetici. L'IGF-1 LR3 è poco solubile a pH neutro, e la letteratura di prodotto pubblicata lo ricostituisce in un acido diluito — comunemente acido cloridrico 10 mM o acido acetico allo 0.1% — prima della diluizione in tampone o terreno. Ricostituirlo direttamente in un tampone neutro comporta il rischio di una dissoluzione incompleta e di aggregazione, che si manifesta come attività incoerente anziché come precipitato visibile.

Il calcolo è semplice: un flaconcino da 1 mg portato a 1 mL fornisce 1 mg/mL, ossia 1,000 mcg/mL; 0.1 mL contengono 100 mcg. Le soluzioni di lavoro per le colture sono di solito diverse diluizioni più in basso. Le soluzioni diluite di qualsiasi proteina perdono materiale sulle superfici di plastica e vetro, per cui una proteina carrier come lo 0.1% di albumina sierica bovina è prassi standard per le soluzioni di lavoro al di sotto di circa 10 mcg/mL. Il metodo generale è nella nostra guida alla ricostituzione.

I flaconcini liofilizzati si conservano a −20 °C o a temperature inferiori, sigillati e al riparo da luce e umidità. Il materiale ricostituito viene aliquotato immediatamente e congelato; ripetuti congelamenti e scongelamenti sono la causa più comune di perdita di attività in una proteina di 9 kDa con tre ponti disolfuro. Indicazioni più ampie sono in come conservare i peptidi.

Purezza, COA e come leggerlo

I certificati di una proteina ricombinante hanno un peso diverso da quelli di un peptide sintetico. La purezza HPLC resta il dato principale, ma per un prodotto di 83 residui le voci più informative sono il risultato di spettrometria di massa, che dovrebbe corrispondere a 9,117.60 g/mol e distinguere così l'analogo LR3 dall'IGF-1 nativo a 7,649 g/mol, e un'eventuale immagine SDS-PAGE, che rivela aggregati e prodotti troncati che un tracciato in fase inversa può nascondere. Anche il contenuto di endotossine è rilevante per l'uso in colture cellulari, poiché i sistemi di espressione batterica sono la fonte abituale. La nostra guida alla lettura del certificato di analisi di un peptide spiega come si collegano queste sezioni.

Stato normativo

L'IGF-1 LR3 non dispone di autorizzazione all'immissione in commercio come medicinale negli Stati Uniti. Una molecola correlata ma distinta, l'IGF-1 umano ricombinante (mecasermina), è un prodotto approvato soggetto a prescrizione per un raro disturbo della crescita; l'IGF-1 LR3 non è quella molecola e non è intercambiabile con essa. L'IGF-1 e i suoi analoghi sono vietati nello sport dalle norme antidoping.

Molecole correlate e letture di approfondimento

I parenti più prossimi sono l'IGF-1 DES (1-3), l'analogo basato sul troncamento, e l'MGF, il peptide del dominio E della variante di splicing IGF-1 Ec, che non è affatto un agonista recettoriale e risponde a una domanda diversa. Un orientamento più ampio si trova nella nostra panoramica della ricerca sui peptidi per la crescita muscolare.