Průvodce molekulami
Co je IGF-1 LR3? Struktura, mechanismus IGF-1R a přehled výzkumu
Co je IGF-1 LR3? Analog IGF-1 o 83 zbytcích navržený k úniku vazebným proteinům IGF — struktura, mechanismus IGF-1R, výsledky výzkumu a kontrola COA.
IGF-1 LR3 je rekombinantní analog lidského inzulinu podobného růstového faktoru 1 o 83 zbytcích, který nese dvě záměrné změny: arginin nahrazující glutamát v pozici 3 a prodloužení o 13 zbytcích přidané na N-konec. Obě modifikace existují z jediného důvodu — zbavit molekulu afinity k vazebným proteinům IGF, které běžně nativní IGF-1 sekvestrují — a přitom ponechat afinitu k receptoru IGF-1 v podstatě nedotčenou. Výsledkem je růstový faktor, který zůstává volný v roztoku i v kultuře se sérem, a proto se stal standardní reagencií v pracích s buněčnými kulturami a receptorovou signalizací dávno předtím, než se objevil v katalozích výzkumných chemikálií.
Peptide Medix EU dodává IGF-1 LR3 jako lyofilizovaný prášek v lahvičkách o obsahu 0.1 mg a 1 mg v rámci sortimentu IGF a svalových peptidů.
Co je IGF-1 LR3?
Název kóduje chemii. „LR3“ znamená Long R3: Long pro N-koncové prodloužení, R3 pro arginin ve zbytku 3. Mateřská molekula, IGF-1, je jednořetězcový protein o 70 aminokyselinách strukturně příbuzný proinzulinu, produkovaný převážně v játrech pod kontrolou růstového hormonu a působící na receptor IGF-1, receptorovou tyrozinkinázu. Nativní IGF-1 cirkuluje téměř zcela navázaný na rodinu šesti vazebných proteinů IGF, které řídí jeho dostupnost a zkracují jeho poločas ve volné formě na několik minut.
IGF-1 LR3 se vyrábí rekombinantní expresí, nikoli syntézou na pevné fázi — s 83 zbytky a hmotností 9,117.60 g/mol je malým proteinem, nikoli peptidem, který by bylo prakticky možné sestavit postupně. Nese číslo CAS 946870-92-4 a sumární vzorec C400H625N111O115S9 se třemi disulfidickými můstky nativního sbalení IGF-1.
Původ a struktura
Obě modifikace cílí na kontakt s vazebnými proteiny, nikoli na kontakt s receptorem. Glutamát 3 se nachází v N-koncové oblasti IGF-1, která vytváří klíčový elektrostatický kontakt s vazebnými proteiny; jeho náhrada argininem obrací lokální náboj a podle publikovaných údajů snižuje afinitu k IGFBP zhruba o dva řády. Prodloužení o 13 zbytcích (MFPAMPLSSLFVN) přidává další sterickou interferenci na stejném rozhraní a také zvyšuje izoelektrický bod molekuly, což mění její vlastnosti při zacházení v roztoku.
Modifikace záměrně ponechávají beze změny povrch vázající receptor. Zbytky, které se dotýkají IGF-1R, leží jinde na sbalené struktuře, takže IGF-1 LR3 zůstává na receptoru plným agonistou. Důsledkem, konzistentně popisovaným v kultivačních systémech, je podstatně vyšší zdánlivá účinnost než u nativního IGF-1 — ne proto, že by analog vázal receptor pevněji, ale proto, že je ho mnohem více volného.
Jak IGF-1 LR3 pravděpodobně působí
IGF-1 LR3 se váže na receptor IGF-1, disulfidicky spojenou tyrozinkinázu α2β2 blízce příbuznou inzulinovému receptoru. Vazba ligandu spouští autofosforylaci kinázové domény β-podjednotky a nábor proteinů substrátu inzulinového receptoru, které se větví do dvou hlavních drah: PI3K/Akt/mTOR, spojované v literatuře s ukazateli proteosyntézy a přežívání buněk, a Ras/Raf/MEK/ERK, spojované s ukazateli proliferace. V myoblastových systémech jsou to právě dráhy, které výzkumníci sledují při měření odpovědi.
Pro experimentální design jsou důležité dvě mechanistické výhrady. Zaprvé, IGF-1R a inzulinový receptor tvoří hybridní receptory a analogy IGF-1 si zachovávají měřitelnou afinitu k izoformě A inzulinového receptoru; selektivita je relativní, nikoli absolutní. Zadruhé, protože analog uniká kontrole vazebnými proteiny, odstraňuje regulační vrstvu, která je součástí biologie nativního IGF-1. Studie využívající IGF-1 LR3 záměrně měří nepufrovanou aktivaci receptoru, což je užitečné pro otázky signalizace, ale méně reprezentativní pro fyziologickou expozici IGF-1.
Co výzkum zkoumal
Buněčné kultury a bioprocesy
Největším a nejlépe zavedeným využitím je doplněk bezsérových médií. Long R3 IGF-1 je v biotechnologické literatuře široce popisován jako náhrada inzulinu v kulturách CHO a hybridomů, kde mu odolnost vůči vazebným proteinům secernovaným samotnými buňkami poskytuje v médiu delší funkční životnost než nativnímu IGF-1. Jde o práci in vitro v průmyslovém měřítku s dobře charakterizovanými výsledky.
Signalizace myoblastů a kosterního svalu
Studie na C2C12 a primárních myoblastech využívaly IGF-1 LR3 ke zkoumání proliferace a diferenciace, fosforylace Akt a hypertrofické signalizace v kultivovaných myotubách. Jde o ukazatele na buněčné úrovni; extrapolace z nich na výsledky na úrovni celého organismu není publikovanými výsledky podložena.
Růstové a metabolické modely u hlodavců
Práce na zvířatech s Long R3 IGF-1 pocházejí převážně z 90. let, včetně studií u potkanů popisujících vyšší růstově podpůrnou účinnost než u ekvimolárního nativního IGF-1, což odpovídá zdůvodnění založenému na vazebných proteinech. Metabolické studie popsaly také hypoglykemické odpovědi odrážející zbytkovou zkříženou reaktivitu s inzulinovým receptorem uvedenou výše.
Srovnávací práce s analogy
IGF-1 LR3 je často studován spolu s IGF-1 DES (1-3), zkráceným analogem, který řeší tentýž problém s vazebnými proteiny delecí místo substituce. Oba se chovají odlišně v tkáních, kde je aktivní proteolýza IGFBP, a volba mezi nimi je skutečným experimentálním rozhodnutím, nikoli otázkou preference — jak je popsáno v našem srovnání IGF-1 LR3 vs IGF-1 DES a v článku o tom, proč tyto modifikace existují.
Dodávané formy a velikosti
Lahvička o obsahu 0.1 mg se hodí pro práci s kulturami na jedné destičce a pro receptorové testy, kde je pracovní koncentrace v rozmezí nanogramů na mililitr; lahvička o obsahu 1 mg je jednotkou pro rozsáhlejší série, které po celou dobu potřebují jednu šarži. Kontroly při nákupu jsou popsány v našem nákupním průvodci pro IGF-1 LR3.
Rekonstituce a skladování v laboratorním kontextu
S rekombinantními růstovými faktory se zachází jinak než s malými syntetickými peptidy. IGF-1 LR3 je při neutrálním pH špatně rozpustný a publikovaná produktová literatura jej rekonstituuje ve zředěné kyselině — obvykle 10 mM kyselině chlorovodíkové nebo 0.1% kyselině octové — před ředěním do pufru nebo média. Rekonstituce přímo do neutrálního pufru hrozí neúplným rozpuštěním a agregací, která se projeví jako nekonzistentní aktivita, nikoli jako viditelná sraženina.
Výpočet je jednoduchý: lahvička o obsahu 1 mg doplněná na 1 mL dává 1 mg/mL, tj. 1,000 mcg/mL; 0.1 mL obsahuje 100 mcg. Pracovní zásobní roztoky pro kultury bývají o několik dalších ředění nižší. Zředěné roztoky jakéhokoli proteinu ztrácejí materiál na plastových a skleněných površích, proto je u pracovních zásobních roztoků pod přibližně 10 mcg/mL standardní praxí nosný protein, například 0.1% hovězí sérový albumin. Obecná metoda je v našem průvodci rekonstitucí.
Lyofilizované lahvičky se uchovávají při −20 °C nebo nižší teplotě, uzavřené a chráněné před světlem a vlhkostí. Rekonstituovaný materiál se ihned rozdělí na alikvoty a zmrazí; opakované zmrazování a rozmrazování je nejčastější příčinou ztráty aktivity u proteinu o 9 kDa se třemi disulfidickými můstky. Širší pokyny jsou v článku o tom, jak skladovat peptidy.
Čistota, COA a jak je číst
Certifikáty pro rekombinantní protein mají jinou váhu než certifikáty pro syntetický peptid. Hlavním údajem zůstává čistota podle HPLC, u produktu o 83 zbytcích jsou však informativnějšími položkami výsledek hmotnostní spektrometrie, který by měl odpovídat 9,117.60 g/mol, a tím odlišuje analog LR3 od nativního IGF-1 se 7,649 g/mol, a případný snímek SDS-PAGE, který odhalí agregaci a zkrácené produkty, jež může záznam z reverzní fáze skrýt. Pro použití v buněčných kulturách je relevantní také obsah endotoxinů, protože obvyklým zdrojem jsou bakteriální expresní systémy. Náš průvodce čtením certifikátu analýzy peptidu popisuje, jak tyto části do sebe zapadají.
Regulační status
IGF-1 LR3 nemá ve Spojených státech registraci jako léčivý přípravek. Příbuzná, ale odlišná molekula, rekombinantní lidský IGF-1 (mecasermin), je schváleným přípravkem na lékařský předpis pro vzácnou poruchu růstu; IGF-1 LR3 není touto molekulou a není s ní zaměnitelný. IGF-1 a jeho analogy jsou ve sportu zakázány antidopingovými pravidly.
Příbuzné molekuly a další četba
Nejbližšími příbuznými jsou IGF-1 DES (1-3), analog založený na zkrácení, a MGF, peptid E-domény ze sestřihové varianty IGF-1 Ec, který vůbec není agonistou receptoru a odpovídá na jinou otázku. Širší orientaci nabízí náš přehled peptidů pro výzkum svalového růstu.
Otázky
Co znamená LR3 v názvu IGF-1 LR3?
Long R3. „Long“ odkazuje na prodloužení o 13 zbytcích přidané na N-konec a „R3“ na arginin nahrazující glutamát ve zbytku 3 nativní sekvence. Obě změny cílí na rozhraní, kde se IGF-1 dotýká svých vazebných proteinů, nikoli na povrch vázající receptor.
Proč je IGF-1 LR3 v kultuře účinnější než nativní IGF-1?
Ne proto, že by vázal receptor pevněji. Snížená afinita k vazebným proteinům IGF znamená, že mnohem více přidaného materiálu zůstává v médiu volného, takže se ho více dostane k receptoru. Popisované rozdíly v účinnosti v kultuře odrážejí dostupnost, nikoli vnitřní afinitu k receptoru.
Jak se IGF-1 LR3 v laboratoři rekonstituuje?
Rekombinantní analogy IGF-1 se při neutrálním pH špatně rozpouštějí, proto je publikovaná produktová literatura rekonstituuje ve zředěné kyselině, například 10 mM HCl nebo 0.1% kyselině octové, a poté ředí do pufru nebo média. U zředěných pracovních zásobních roztoků je standardem nosný protein, například 0.1% BSA, k omezení ztrát adsorpcí.
Jakou molekulovou hmotnost by měl certifikát analýzy ukazovat?
9,117.60 g/mol, sumární vzorec C400H625N111O115S9, CAS 946870-92-4. Tato hodnota zároveň odlišuje analog LR3 od nativního lidského IGF-1 se zhruba 7,649 g/mol, což je nejužitečnější kontrola identity na záznamu hmotnostní spektrometrie.
Jak se IGF-1 LR3 liší od IGF-1 DES?
Oba snižují afinitu k vazebným proteinům, ale opačnými strategiemi: LR3 přidává prodloužení a nahrazuje zbytek 3, zatímco DES (1-3) první tři zbytky zcela odstraňuje. V tkáních s aktivní proteolýzou IGFBP se chovají odlišně a volba mezi nimi je skutečným experimentálním rozhodnutím.
Je IGF-1 LR3 totéž co mecasermin na předpis?
Ne. Mecasermin je rekombinantní lidský IGF-1 s nativní sekvencí o 70 zbytcích, schválený jako léčivý přípravek na lékařský předpis pro vzácnou poruchu růstu. IGF-1 LR3 je modifikovaný analog o 83 zbytcích a oba nejsou zaměnitelné.
Jaké jsou hlavní výzkumné aplikace?
Bezsérové buněčné kultury a bioprocesy, kde nahrazuje inzulin v systémech CHO a hybridomů; studie signalizace myoblastů sledující dráhy Akt a ERK; a srovnávací práce s analogy oproti nativnímu IGF-1 a IGF-1 DES. Výsledky jsou in vitro a preklinické.