Czym jest IGF-1 LR3? Budowa, mechanizm IGF-1R i przegląd badań

IGF-1 LR3 to 83-resztowy rekombinowany analog ludzkiego insulinopodobnego czynnika wzrostu 1, zawierający dwie celowe zmiany: argininę w miejsce glutaminianu w pozycji 3 oraz 13-resztowe przedłużenie dołączone do N-końca. Obie modyfikacje służą jednemu celowi — pozbawieniu cząsteczki powinowactwa do białek wiążących IGF, które normalnie sekwestrują natywny IGF-1 — przy zasadniczo niezmienionym powinowactwie do receptora IGF-1. W efekcie powstaje czynnik wzrostu, który pozostaje wolny w roztworze i w hodowlach zawierających surowicę; dlatego stał się standardowym odczynnikiem w pracach nad hodowlami komórkowymi i sygnalizacją receptorową na długo przed pojawieniem się w katalogach odczynników badawczych.

Peptide Medix EU dostarcza IGF-1 LR3 w postaci liofilizowanego proszku w fiolkach 0.1 mg i 1 mg w ramach asortymentu peptydów IGF i mięśniowych.

Czym jest IGF-1 LR3?

Nazwa odzwierciedla chemię. „LR3” to Long R3: Long od przedłużenia N-końcowego, R3 od argininy w reszcie 3. Cząsteczka macierzysta, IGF-1, to 70-aminokwasowe białko jednołańcuchowe spokrewnione strukturalnie z proinsuliną, wytwarzane głównie w wątrobie pod kontrolą hormonu wzrostu i działające na receptor IGF-1, będący receptorową kinazą tyrozynową. Natywny IGF-1 krąży niemal w całości związany z rodziną sześciu białek wiążących IGF, które kontrolują jego dostępność i skracają jego okres półtrwania w postaci wolnej do kilku minut.

IGF-1 LR3 wytwarza się metodą ekspresji rekombinowanej, a nie syntezy na fazie stałej — przy 83 resztach i masie 9,117.60 g/mol jest to małe białko, a nie peptyd, który dałoby się w praktyce złożyć stopniowo. Ma numer CAS 946870-92-4 i wzór cząsteczkowy C400H625N111O115S9, z trzema mostkami disiarczkowymi natywnego fałdowania IGF-1.

Pochodzenie i budowa

Obie modyfikacje dotyczą kontaktu z białkami wiążącymi, a nie z receptorem. Glutaminian 3 znajduje się w N-końcowym regionie IGF-1, który tworzy kluczowy kontakt elektrostatyczny z białkami wiążącymi; zastąpienie go argininą odwraca ładunek lokalny i według doniesień zmniejsza powinowactwo do IGFBP o mniej więcej dwa rzędy wielkości. 13-resztowe przedłużenie (MFPAMPLSSLFVN) wprowadza dodatkową zawadę przestrzenną na tym samym styku, a także podnosi punkt izoelektryczny cząsteczki, co zmienia jej właściwości w roztworze.

Modyfikacje celowo pozostawiają nienaruszoną powierzchnię wiążącą receptor. Reszty kontaktujące się z IGF-1R znajdują się w innym miejscu fałdu, dlatego IGF-1 LR3 pozostaje pełnym agonistą receptora. Konsekwencją, spójnie opisywaną w układach hodowlanych, jest znacznie większa pozorna siła działania niż natywnego IGF-1 — nie dlatego, że analog wiąże receptor silniej, lecz dlatego, że znacznie większa jego część pozostaje wolna i może się z nim związać.

Jak prawdopodobnie działa IGF-1 LR3

IGF-1 LR3 wiąże receptor IGF-1 — połączoną mostkami disiarczkowymi kinazę tyrozynową o budowie α2β2, blisko spokrewnioną z receptorem insulinowym. Związanie liganda wyzwala autofosforylację domeny kinazowej podjednostki β i rekrutację białek z rodziny substratów receptora insulinowego, co rozgałęzia się na dwa główne szlaki: PI3K/Akt/mTOR, wiązany w literaturze z odczytami syntezy białek i przeżywalności komórek, oraz Ras/Raf/MEK/ERK, wiązany z odczytami proliferacji. W układach mioblastów to właśnie te szlaki badacze analizują przy pomiarze odpowiedzi.

Dla projektu doświadczenia istotne są dwa zastrzeżenia mechanistyczne. Po pierwsze, IGF-1R i receptor insulinowy tworzą receptory hybrydowe, a analogi IGF-1 zachowują mierzalne powinowactwo do izoformy A receptora insulinowego; selektywność jest względna, a nie bezwzględna. Po drugie, ponieważ analog wymyka się kontroli białek wiążących, usuwa warstwę regulacyjną stanowiącą część natywnej biologii IGF-1. Badanie z użyciem IGF-1 LR3 celowo mierzy niebuforowaną aktywację receptora, co jest przydatne przy pytaniach o sygnalizację, ale słabiej odzwierciedla fizjologiczną ekspozycję na IGF-1.

Co badano

Hodowle komórkowe i bioprocesy

Najszersze i najlepiej ugruntowane zastosowanie to suplement podłoży bezsurowiczych. Long R3 IGF-1 jest szeroko opisywany w literaturze biotechnologicznej jako zamiennik insuliny w hodowlach komórek CHO i hybrydom, gdzie jego odporność na białka wiążące wydzielane przez same komórki zapewnia mu dłuższe funkcjonalne życie w podłożu niż natywnemu IGF-1. Są to prace in vitro w skali przemysłowej, z dobrze scharakteryzowanymi wynikami.

Sygnalizacja w mioblastach i mięśniach szkieletowych

W badaniach na komórkach C2C12 i pierwotnych mioblastach IGF-1 LR3 stosowano do analizy proliferacji i różnicowania, fosforylacji Akt oraz sygnalizacji przerostowej w hodowanych miotubach. Są to odczyty na poziomie komórkowym; opublikowane dane nie uzasadniają ekstrapolacji z nich na efekty w całym organizmie.

Modele wzrostu i metabolizmu u gryzoni

Prace na zwierzętach z Long R3 IGF-1 pochodzą głównie z lat 90., w tym badania na szczurach opisujące silniejsze działanie pobudzające wzrost niż równomolowej ilości natywnego IGF-1, co jest zgodne z uzasadnieniem opartym na białkach wiążących. W badaniach metabolicznych opisano także odpowiedzi hipoglikemiczne, odzwierciedlające wspomnianą wyżej resztkową reaktywność krzyżową z receptorem insulinowym.

Prace porównawcze nad analogami

IGF-1 LR3 często bada się równolegle z IGF-1 DES (1-3) — skróconym analogiem, który rozwiązuje ten sam problem białek wiążących przez delecję zamiast podstawienia. Oba zachowują się różnie w tkankach z aktywną proteolizą IGFBP, a wybór między nimi jest rzeczywistą decyzją eksperymentalną, a nie kwestią preferencji — omówiono to w naszym porównaniu IGF-1 LR3 vs IGF-1 DES oraz w artykule o tym, dlaczego te modyfikacje istnieją.

Dostępne formy i wielkości

Fiolka 0.1 mg odpowiada pracom hodowlanym na pojedynczej płytce i testom receptorowym, w których stężenie robocze mieści się w zakresie nanogramów na mililitr; fiolka 1 mg jest jednostką dla dłuższych serii wymagających jednej partii w całym przebiegu. Kontrole przy zakupie omawia nasz przewodnik zakupowy IGF-1 LR3.

Rekonstytucja i przechowywanie w warunkach laboratoryjnych

Z rekombinowanymi czynnikami wzrostu postępuje się inaczej niż z małymi peptydami syntetycznymi. IGF-1 LR3 słabo rozpuszcza się w obojętnym pH, a w opublikowanej literaturze produktowej poddaje się go rekonstytucji w rozcieńczonym kwasie — zwykle 10 mM kwasie solnym lub 0.1% kwasie octowym — przed rozcieńczeniem w buforze lub podłożu. Rekonstytucja bezpośrednio w obojętnym buforze grozi niepełnym rozpuszczeniem i agregacją, co objawia się niespójną aktywnością, a nie widocznym osadem.

Obliczenia są proste: fiolka 1 mg uzupełniona do 1 mL daje 1 mg/mL, czyli 1,000 mcg/mL; 0.1 mL zawiera 100 mcg. Roztwory robocze do hodowli są zwykle kilkakrotnie dalej rozcieńczone. Rozcieńczone roztwory każdego białka tracą materiał na powierzchniach plastikowych i szklanych, dlatego dla roztworów roboczych poniżej około 10 mcg/mL standardem jest białko nośnikowe, np. 0.1% albumina surowicy bydlęcej. Ogólną metodę opisuje nasz przewodnik po rekonstytucji.

Fiolki z liofilizatem przechowuje się w temperaturze −20 °C lub niższej, zamknięte i chronione przed światłem i wilgocią. Materiał po rekonstytucji niezwłocznie dzieli się na porcje i zamraża; wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie jest najczęstszą przyczyną utraty aktywności białka 9 kDa z trzema mostkami disiarczkowymi. Szersze wskazówki zawiera artykuł o przechowywaniu peptydów.

Czystość, COA i jak go czytać

Certyfikaty białka rekombinowanego mają inną wymowę niż certyfikaty peptydu syntetycznego. Czystość HPLC pozostaje wartością nagłówkową, ale w przypadku produktu 83-resztowego bardziej informatywne są wynik spektrometrii mas, który powinien odpowiadać 9,117.60 g/mol, a tym samym odróżniać analog LR3 od natywnego IGF-1 o masie 7,649 g/mol, oraz ewentualny obraz SDS-PAGE, ujawniający agregaty i produkty skrócenia, które chromatogram w odwróconej fazie może ukryć. W zastosowaniach w hodowlach komórkowych istotna jest także zawartość endotoksyn, ponieważ zwykłym źródłem są bakteryjne systemy ekspresyjne. Nasz przewodnik po czytaniu certyfikatu analizy peptydu wyjaśnia, jak te sekcje się uzupełniają.

Status regulacyjny

IGF-1 LR3 nie ma w Stanach Zjednoczonych pozwolenia na dopuszczenie do obrotu jako lek. Spokrewniona, lecz odrębna cząsteczka — rekombinowany ludzki IGF-1 (mekasermina) — jest zatwierdzonym produktem na receptę w rzadkim zaburzeniu wzrostu; IGF-1 LR3 nie jest tą cząsteczką i nie może jej zastępować. IGF-1 i jego analogi są zakazane w sporcie na mocy przepisów antydopingowych.

Powiązane cząsteczki i dalsza lektura

Najbliższymi odpowiednikami są IGF-1 DES (1-3) — analog oparty na skróceniu — oraz MGF, peptyd domeny E z wariantu splicingowego IGF-1 Ec, który w ogóle nie jest agonistą receptora i odpowiada na inne pytanie. Szerszy kontekst przedstawia nasz przegląd peptydów w badaniach nad wzrostem mięśni.