Guías de moléculas
Anticuerpos policlonales y antisueros: qué son y cómo elegirlos
Cómo elegir un anticuerpo antipéptido: antisuero o IgG purificada, inmunógeno y epítopo, reactividad de especie, controles de bloqueo y almacenamiento.
Los anticuerpos policlonales y los antisueros son los reactivos de detección de la investigación peptídica: generados en un animal huésped frente a un inmunógeno peptídico definido, reconocen la diana en cortes de tejido, en blots y en inmunoensayos. La sección de anticuerpos del catálogo está dominada por los policlonales y no por los monoclonales por una razón concreta: los péptidos cortos presentan pocos epítopos, y una respuesta policlonal que abarque varios de ellos detecta la diana de forma más robusta que un único clon monoclonal frente a una molécula que puede tener solo diez residuos.
Antisuero, IgG purificada o purificado por afinidad: qué está comprando realmente
Las entradas del glosario sobre antisuero, IgG purificada y policlonal frente a monoclonal exponen las diferencias con más detalle. Las entradas del catálogo indican el formato de cada artículo; "anticuerpo" por sí solo no es una especificación suficiente.
El inmunógeno es la especificación
Todo el comportamiento de un anticuerpo antipéptido se deriva de aquello frente a lo que se generó. La secuencia del inmunógeno indica qué región de la molécula de origen se reconoce, lo que determina tres cosas que necesita saber antes de hacer el pedido. ¿Distingue las formas procesadas? Un anticuerpo generado frente al extremo C-terminal de un péptido no reconocerá un precursor prolongado en el extremo C-terminal, que es exactamente lo que se quiere si se mide la hormona madura, y justo lo contrario si se mide la forma total. ¿Presenta reactividad cruzada dentro de la familia? Los antisueros frente a la región media conservada de los productos del proglucagón reconocen por igual glucagón, glicentina y oxintomodulina. ¿Se requiere una modificación? Los anticuerpos específicos de fosforilación y de amidación se generan frente a inmunógenos modificados y no deberían reconocer la secuencia sin modificar; esa especificidad es todo el valor del reactivo en el trabajo con tau y neuropéptidos.
Especie huésped, reactividad de especie y las dos formas en que importan
Son especificaciones distintas y ambas importan. La especie huésped —normalmente conejo, a veces cabra, oveja o cobaya— determina qué anticuerpo secundario se necesita y qué primarios pueden combinarse en multiplex. Dos primarios de conejo no pueden distinguirse mediante el secundario en el mismo corte. La reactividad de especie indica qué versión de la diana, según el organismo, reconoce el anticuerpo, y se deriva de la conservación de la secuencia, no del huésped. Un anticuerpo de conejo generado frente al beta-amiloide humano puede reconocer o no la secuencia de roedor; la entrada del catálogo indica la reactividad probada, y las especies no probadas deben tratarse como desconocidas y no como supuestas. Consulte reactividad de especie.
Validación: los controles que hacen publicable un resultado
La especificidad de los anticuerpos es el problema de reproducibilidad más frecuente en la investigación peptídica, y los controles están bien establecidos. El control con péptido de bloqueo es el principal: preincube el anticuerpo con un exceso de péptido inmunógeno, y la tinción o la banda específicas deberían desaparecer mientras la señal inespecífica persiste. La mayoría de los antisueros del catálogo disponen de un péptido de bloqueo correspondiente, y utilizarlo marca la diferencia entre una imagen sugerente y una respaldada por evidencia. Además: una muestra knockout o knockdown cuando exista, un control solo con secundario y, para las afirmaciones cuantitativas, confirmación ortogonal por espectrometría de masas o un anticuerpo independiente frente a un epítopo distinto. Los campos en los que la validación de anticuerpos se ha cuestionado públicamente, como el de la irisina, son exactamente aquellos en los que estos controles son innegociables.
Especificaciones de aplicación y su significado
Las entradas del catálogo enumeran las aplicaciones validadas con diluciones de trabajo sugeridas: normalmente inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, Western blot, ELISA, RIA e inmunoprecipitación. Se aplican dos precauciones. En primer lugar, un anticuerpo validado para una aplicación puede fallar en otra: los reactivos que reconocen epítopos conformacionales funcionan a menudo en inmunohistoquímica y fallan en un Western desnaturalizante, mientras que los anticuerpos frente a epítopos lineales suelen mostrar el patrón opuesto. En segundo lugar, las diluciones de trabajo son puntos de partida que deben titularse en su propio sistema, no valores fijos: el tipo de muestra, la fijación y la química de detección desplazan el óptimo. El trabajo de inmunoprecipitación combina por lo general el anticuerpo con perlas magnéticas, y los anticuerpos marcados llevan los conjugados utilizados para la detección directa.
Almacenamiento y manipulación
Los anticuerpos son proteínas en solución y se manipulan de forma muy distinta a los péptidos liofilizados. Divídalos en alícuotas a su llegada: esto importa más en los anticuerpos que en casi cualquier otro producto del catálogo, porque la congelación-descongelación repetida agrega la IgG y reduce el título de forma irreversible. Conserve las alícuotas de un solo uso a −20 °C, o a 2–8 °C en el caso de una alícuota de trabajo de uso a corto plazo, y tenga en cuenta el conservante indicado en el vial: la azida sódica es habitual y es incompatible con la detección con peroxidasa de rábano, por lo que los anticuerpos con azida deben dializarse antes de la conjugación con HRP. Los antisueros liofilizados deben reconstituirse en el volumen de agua indicado y dividirse en alícuotas inmediatamente. Evite los congeladores sin escarcha (no frost), cuyos ciclos de descongelación someten las existencias a descongelaciones parciales repetidas. Los principios generales se recogen en la guía de preparación de alícuotas y en la guía de almacenamiento.
Dónde encajan los anticuerpos frente a los demás tipos de producto
Solicite un anticuerpo cuando necesite detectar o localizar la molécula endógena en tejido, células o un lisado. Solicite el patrón peptídico correspondiente como control con péptido de bloqueo y como control positivo en un blot. Solicite un kit ELISA o RIA cuando la pregunta sea cuánta diana hay en una muestra: el kit incluye un par de anticuerpos emparejados, patrones y un intervalo validado, y es más rápido y reproducible que ensamblar las piezas. Empiece por el portal del catálogo o por una temática como el alzhéimer, el cáncer o la diabetes, en las que la selección de anticuerpos soporta la mayor parte del peso experimental. Todos los artículos del catálogo se suministran exclusivamente para investigación in vitro y en animales autorizada, y ninguno es un reactivo diagnóstico.
Preguntas
¿Por qué los anticuerpos antipéptido suelen ser policlonales y no monoclonales?
Porque los péptidos cortos presentan pocos epítopos. Una respuesta policlonal abarca varios de ellos, lo que proporciona una detección más robusta cuando un único epítopo queda enmascarado por la fijación, la desnaturalización o un compañero de unión. Los monoclonales ofrecen homogeneidad entre lotes y precisión de epítopo único, algo importante en el trabajo específico de fosforilación, pero para la mayoría de los péptidos pequeños un policlonal bien purificado detecta de forma más fiable.
¿Debo comprar antisuero completo o anticuerpo purificado por afinidad?
Antisuero para RIA y EIA, donde el fondo es tolerable y el coste por ensayo importa. Purificado por afinidad para inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y Western blots de baja abundancia, donde la inmunoglobulina sérica inespecífica produce un fondo que ningún bloqueo elimina. La IgG purificada con proteína A/G se sitúa entre ambos y resulta útil sobre todo cuando se necesita una concentración de IgG definida.
¿Cómo confirmo que un anticuerpo es específico?
Realice el control con péptido de bloqueo: preincube con un exceso de péptido inmunógeno y confirme que la señal específica desaparece mientras el fondo persiste. Añada un control solo con secundario y una muestra knockout o knockdown cuando esté disponible. Para las afirmaciones cuantitativas, confirme con un segundo anticuerpo frente a un epítopo distinto o por espectrometría de masas. Cite los controles en sus métodos.
¿Puedo utilizar un mismo anticuerpo para inmunohistoquímica y Western blot?
Solo si está validado para ambas. Los anticuerpos que reconocen epítopos conformacionales funcionan a menudo en tejido fijado y fallan tras la desnaturalización con SDS; los anticuerpos frente a epítopos lineales muestran con frecuencia lo contrario. La entrada del catálogo enumera las aplicaciones probadas: una aplicación no incluida está sin probar, no simplemente desaconsejada, y debe validarse primero en su propio sistema.
¿Por qué pierde actividad mi anticuerpo con el tiempo?
Casi siempre por la congelación-descongelación. Cada ciclo agrega una fracción de la IgG, y la pérdida es acumulativa e irreversible. Divídalo en alícuotas de un solo uso a su llegada y no vuelva a congelar nunca una alícuota de trabajo. Los congeladores sin escarcha empeoran el problema por sus ciclos de descongelación. La conservación a 2–8 °C con el conservante indicado es adecuada para una alícuota en uso activo.
¿Qué efecto tiene la azida sódica del vial?
Conserva el anticuerpo, pero inhibe la peroxidasa de rábano, por lo que un anticuerpo con azida no puede conjugarse con HRP ni utilizarse en algunos formatos de detección directa sin dializarlo antes. Además, es tóxica y requiere una eliminación adecuada. Existen formatos sin azida para el trabajo de conjugación; compruebe la composición del tampón en la entrada del catálogo.