Fluorescent label (FAM / FITC)

FAM (5- of 6-carboxyfluoresceïne) en FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat) zijn de twee meest gebruikte op fluoresceïne gebaseerde labels voor synthetische peptiden. Beide absorberen rond 495 nm en emitteren rond 520 nm — standaard-FITC-filtersets en de 488 nm-laserlijn op elke flowcytometer of confocale microscoop.

Waarom de twee niet uitwisselbaar zijn

De chemie verschilt op het aanhechtingspunt. FITC reageert met een vrij amine tot een thioureumbinding, die gevoelig is voor langzame hydrolyse en in oplossing over maanden kan afbreken. FAM wordt als carbonzuur gekoppeld tot een stabiele amidebinding, zodat met FAM gelabelde peptiden doorgaans de voorkeur hebben waar opslagstabiliteit of kwantitatief werk belangrijk is. Labels worden normaal gesproken aan de N-terminus of aan een lysinezijketen geplaatst, vaak via een aminohexaanzuur- of PEG-spacer, zodat de omvangrijke fluorofoor de binding aan het doelwit niet verstoort.

Hanteringsnotities: fluoresceïne is sterk pH-gevoelig en verliest onder ongeveer pH 7 aan intensiteit, bleekt snel uit en is lichtgevoelig vanaf het moment dat de flacon wordt geopend — amberkleurige flacons, folie en gedempte verlichting zijn standaard. Het molecuulgewicht van een gelabeld peptide en de zuiverheid verschuiven beide ten opzichte van de ongelabelde sequentie, dus lees het COA voor het conjugaat en niet voor het moedermolecuul.

Gerelateerde termen en materiaal

biotinelabel · I-125-radiolabel · HPLC. Referentiemateriaal: gelabelde peptiden. Verder lezen: gids over gelabelde peptiden.