Fluorescenční značka (FAM / FITC)

FAM (5- nebo 6-karboxyfluorescein) a FITC (fluorescein-isothiokyanát) jsou dvě nejběžnější fluoresceinové značky připojované k syntetickým peptidům. Obě absorbují kolem 495 nm a emitují kolem 520 nm — standardní filtrové sady FITC a laserová linie 488 nm na jakémkoli průtokovém cytometru či konfokálním mikroskopu.

Proč nejsou obě značky zaměnitelné

Chemie se liší v místě připojení. FITC reaguje s volným aminem za vzniku thiomočovinové vazby, která podléhá pomalé hydrolýze a v roztoku se může během měsíců rozkládat. FAM se kopuluje jako karboxylová kyselina za vzniku stabilní amidové vazby, takže peptidy značené FAM jsou obecně preferovány tam, kde záleží na stabilitě při skladování nebo na kvantitativní práci. Značky se obvykle umisťují na N-konec nebo na postranní řetězec lysinu, často přes spacer z kyseliny aminohexanové nebo PEG, aby objemný fluorofor nerušil vazbu na cíl.

Poznámky k manipulaci: fluorescein je výrazně citlivý na pH a pod pH přibližně 7 ztrácí intenzitu, rychle fotobleší a je citlivý na světlo od okamžiku otevření lahvičky — standardem jsou jantarové lahvičky, alobal a omezené osvětlení. Molekulová hmotnost značeného peptidu i čistota se oproti neznačené sekvenci posouvají, proto čtěte COA pro konjugát, nikoli pro výchozí peptid.

Související pojmy a materiály

biotinová značka · radioaktivní značka I-125 · HPLC. Referenční materiál: značené peptidy. Další čtení: průvodce značenými peptidy.