Glossaire
Marquage fluorescent (FAM / FITC)
FAM et FITC sont des marqueurs peptidiques dérivés de la fluorescéine, de chimie de liaison et de stabilité différentes. Ex/Em ~495/520 nm, pH et manipulation.
Le FAM (5- ou 6-carboxyfluorescéine) et le FITC (isothiocyanate de fluorescéine) sont les deux marqueurs dérivés de la fluorescéine les plus courants fixés sur des peptides synthétiques. Tous deux absorbent vers 495 nm et émettent vers 520 nm — filtres FITC standard et raie laser à 488 nm de tout cytomètre en flux ou microscope confocal.
Pourquoi les deux ne sont pas interchangeables
La chimie diffère au point de fixation. Le FITC réagit avec une amine libre pour former une liaison thiourée, sujette à une lente hydrolyse et susceptible de se dégrader en quelques mois en solution. Le FAM est couplé sous forme d’acide carboxylique pour former une liaison amide stable ; les peptides marqués au FAM sont donc généralement préférés lorsque la stabilité au stockage ou le travail quantitatif importent. Les marqueurs sont normalement placés à l’extrémité N-terminale ou sur une chaîne latérale de lysine, souvent via un espaceur d’acide aminohexanoïque ou de PEG afin que le fluorophore encombrant ne gêne pas la liaison à la cible.
Notes de manipulation : la fluorescéine est nettement sensible au pH, perdant de l’intensité en dessous d’environ pH 7, photoblanchit rapidement et est sensible à la lumière dès l’ouverture du flacon — flacons ambrés, papier aluminium et éclairage réduit sont la norme. La masse moléculaire d’un peptide marqué et sa pureté diffèrent toutes deux de celles de la séquence non marquée : lisez le COA du conjugué plutôt que celui du parent.
Termes et matériels associés
marquage à la biotine · radiomarquage I-125 · HPLC. Matériel de référence : peptides marqués. Pour aller plus loin : guide des peptides marqués.