Marcatura fluorescente (FAM / FITC)

FAM (5- o 6-carbossifluoresceina) e FITC (fluoresceina isotiocianato) sono le due marcature a base di fluoresceina più comuni applicate ai peptidi sintetici. Entrambe assorbono intorno a 495 nm ed emettono intorno a 520 nm: set di filtri FITC standard e linea laser a 488 nm di qualsiasi citofluorimetro o microscopio confocale.

Perché le due non sono intercambiabili

La chimica differisce nel punto di attacco. Il FITC reagisce con un'ammina libera formando un legame tiourea, soggetto a lenta idrolisi e che può degradarsi nel giro di mesi in soluzione. Il FAM viene accoppiato come acido carbossilico formando un legame ammidico stabile, per cui i peptidi marcati con FAM sono generalmente preferiti quando contano la stabilità alla conservazione o il lavoro quantitativo. Le marcature si collocano normalmente all'N-terminale o sulla catena laterale di una lisina, spesso tramite uno spaziatore di acido amminoesanoico o PEG, affinché il voluminoso fluoroforo non interferisca con il legame al bersaglio.

Note di manipolazione: la fluoresceina è marcatamente sensibile al pH, perde intensità al di sotto di circa pH 7, va incontro rapidamente a fotosbiancamento ed è sensibile alla luce dal momento in cui si apre il flaconcino: flaconcini ambrati, carta stagnola e illuminazione ridotta sono la norma. Peso molecolare del peptide marcato e purezza cambiano entrambi rispetto alla sequenza non marcata, per cui occorre leggere il COA del coniugato anziché quello del progenitore.

Termini e materiali correlati

marcatura con biotina · radiomarcatura con I-125 · HPLC. Materiale di riferimento: peptidi marcati. Approfondimenti: guida ai peptidi marcati.