Marcação fluorescente (FAM / FITC)

O FAM (5- ou 6-carboxifluoresceína) e o FITC (isotiocianato de fluoresceína) são os dois marcadores à base de fluoresceína mais comuns ligados a péptidos sintéticos. Ambos absorvem perto de 495 nm e emitem perto de 520 nm — os conjuntos de filtros FITC padrão e a linha laser de 488 nm de qualquer citómetro de fluxo ou microscópio confocal.

Porque os dois não são intermutáveis

A química difere no ponto de ligação. O FITC reage com uma amina livre formando uma ligação tioureia, que é propensa a hidrólise lenta e se pode degradar ao longo de meses em solução. O FAM é acoplado como ácido carboxílico, formando uma ligação amida estável, pelo que os péptidos marcados com FAM são geralmente preferidos quando a estabilidade no armazenamento ou o trabalho quantitativo são importantes. Os marcadores são normalmente colocados no terminal N ou numa cadeia lateral de lisina, muitas vezes através de um espaçador de ácido amino-hexanoico ou de PEG, para que o fluoróforo volumoso não interfira com a ligação ao alvo.

Notas de manuseamento: a fluoresceína é marcadamente sensível ao pH, perdendo intensidade abaixo de cerca de pH 7, sofre fotobranqueamento rapidamente e é sensível à luz desde o momento em que o frasco é aberto — frascos âmbar, folha de alumínio e iluminação reduzida são a norma. O peso molecular de um péptido marcado e a sua pureza alteram-se ambos relativamente à sequência não marcada, pelo que deve ler o COA do conjugado e não o do péptido original.

Termos e material relacionados

marcação com biotina · marcação radioativa com I-125 · HPLC. Material de referência: péptidos marcados. Leitura complementar: guia de péptidos marcados.