Glosario
Marcaje fluorescente (FAM / FITC)
FAM y FITC son marcajes peptídicos basados en fluoresceína con distinta química de unión y estabilidad. Ex/Em ~495/520 nm, sensibilidad al pH y manipulación.
FAM (5- o 6-carboxifluoresceína) y FITC (isotiocianato de fluoresceína) son los dos marcajes basados en fluoresceína más habituales en péptidos sintéticos. Ambos absorben cerca de 495 nm y emiten cerca de 520 nm: los juegos de filtros FITC estándar y la línea láser de 488 nm de cualquier citómetro de flujo o microscopio confocal.
Por qué no son intercambiables
La química difiere en el punto de unión. El FITC reacciona con una amina libre y forma un enlace de tiourea, propenso a una hidrólisis lenta que puede degradarlo en solución a lo largo de meses. El FAM se acopla como ácido carboxílico y forma un enlace amida estable, por lo que en general se prefieren los péptidos marcados con FAM cuando importan la estabilidad en almacenamiento o el trabajo cuantitativo. Los marcajes se sitúan normalmente en el extremo N-terminal o en la cadena lateral de una lisina, a menudo mediante un espaciador de ácido aminohexanoico o de PEG para que el voluminoso fluoróforo no interfiera con la unión a la diana.
Notas de manipulación: la fluoresceína es muy sensible al pH y pierde intensidad por debajo de pH 7 aproximadamente, se fotoblanquea con rapidez y es sensible a la luz desde el momento en que se abre el vial; los viales ámbar, el papel de aluminio y la iluminación reducida son la norma. El peso molecular de un péptido marcado y su pureza cambian respecto a la secuencia sin marcar, así que lea el COA del conjugado y no el del péptido original.
Términos y material relacionados
marcaje con biotina · radiomarcaje con I-125 · HPLC. Material de referencia: péptidos marcados. Lectura adicional: guía de péptidos marcados.