Marcaj fluorescent (FAM / FITC)

FAM (5- sau 6-carboxifluoresceina) și FITC (izotiocianatul de fluoresceină) sunt cele mai frecvente două marcaje pe bază de fluoresceină atașate peptidelor sintetice. Ambele absorb în jurul valorii de 495 nm și emit în jurul valorii de 520 nm — seturile de filtre FITC standard și linia laser de 488 nm a oricărui citometru în flux sau microscop confocal.

De ce cele două nu sunt interschimbabile

Chimia diferă la punctul de atașare. FITC reacționează cu o amină liberă formând o legătură de tip tiouree, predispusă la hidroliză lentă, care se poate degrada în câteva luni în soluție. FAM este cuplat ca acid carboxilic, formând o legătură amidică stabilă, astfel încât peptidele marcate cu FAM sunt în general preferate acolo unde contează stabilitatea la depozitare sau lucrul cantitativ. Marcajele se plasează în mod normal la capătul N-terminal sau pe catena laterală a unei lizine, adesea printr-un distanțier de acid aminohexanoic sau PEG, astfel încât fluoroforul voluminos să nu interfereze cu legarea de țintă.

Note de manipulare: fluoresceina este puternic sensibilă la pH, pierzând din intensitate sub aproximativ pH 7, se fotodecolorează rapid și este sensibilă la lumină din momentul deschiderii flaconului — flacoanele de culoare brună, folia și iluminarea redusă sunt standard. Masa moleculară a unei peptide marcate și puritatea acesteia se modifică ambele față de secvența nemarcată, așa că citiți COA-ul pentru conjugat, nu pentru peptida de bază.

Termeni și materiale înrudite

marcaj cu biotină · radiomarcaj I-125 · HPLC. Material de referință: peptide marcate. Lectură suplimentară: ghidul peptidelor marcate.