Słownik
Znacznik fluorescencyjny (FAM / FITC)
FAM i FITC to znaczniki peptydów na bazie fluoresceiny o różnej chemii wiązania i stabilności. Ex/Em ~495/520 nm, wrażliwość na pH i postępowanie.
FAM (5- lub 6-karboksyfluoresceina) i FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) to dwa najczęstsze znaczniki na bazie fluoresceiny przyłączane do peptydów syntetycznych. Oba absorbują w pobliżu 495 nm i emitują w pobliżu 520 nm — odpowiadają standardowym zestawom filtrów FITC oraz linii lasera 488 nm w każdym cytometrze przepływowym czy mikroskopie konfokalnym.
Dlaczego nie są zamienne
Chemia różni się w miejscu przyłączenia. FITC reaguje z wolną grupą aminową, tworząc wiązanie tiomocznikowe, które ulega powolnej hydrolizie i może degradować w roztworze w ciągu miesięcy. FAM sprzęga się jako kwas karboksylowy, tworząc trwałe wiązanie amidowe, dlatego peptydy znakowane FAM są zwykle preferowane tam, gdzie liczy się stabilność podczas przechowywania lub praca ilościowa. Znaczniki umieszcza się zazwyczaj na N-końcu lub w łańcuchu bocznym lizyny, często poprzez łącznik z kwasu aminoheksanowego lub PEG, aby duży fluorofor nie zakłócał wiązania z celem.
Uwagi praktyczne: fluoresceina jest wyraźnie wrażliwa na pH i traci intensywność poniżej około pH 7, szybko ulega fotowybielaniu i jest wrażliwa na światło od chwili otwarcia fiolki — standardem są fiolki z ciemnego szkła, folia i ograniczone oświetlenie. Masa cząsteczkowa znakowanego peptydu i jego czystość różnią się od wartości dla sekwencji nieznakowanej, dlatego należy czytać COA dla koniugatu, a nie dla peptydu macierzystego.
Powiązane terminy i materiały
znacznik biotynowy · znacznik radioaktywny I-125 · HPLC. Materiały referencyjne: peptydy znakowane. Dalsza lektura: przewodnik po peptydach znakowanych.