Fluoreszenzmarkierung (FAM / FITC)

FAM (5- oder 6-Carboxyfluorescein) und FITC (Fluoresceinisothiocyanat) sind die beiden häufigsten Fluorescein-basierten Markierungen an synthetischen Peptiden. Beide absorbieren bei etwa 495 nm und emittieren bei etwa 520 nm — Standard-FITC-Filtersätze und die 488-nm-Laserlinie jedes Durchflusszytometers oder Konfokalmikroskops.

Warum beide nicht austauschbar sind

Die Chemie unterscheidet sich an der Kopplungsstelle. FITC reagiert mit einem freien Amin zu einer Thioharnstoff-Verknüpfung, die zu langsamer Hydrolyse neigt und sich in Lösung über Monate zersetzen kann. FAM wird als Carbonsäure über eine stabile Amidbindung gekoppelt, weshalb FAM-markierte Peptide im Allgemeinen bevorzugt werden, wo Lagerstabilität oder quantitative Arbeit zählt. Markierungen werden normalerweise am N-Terminus oder an einer Lysin-Seitenkette angebracht, oft über einen Aminohexansäure- oder PEG-Spacer, damit das sperrige Fluorophor die Zielbindung nicht stört.

Hinweise zur Handhabung: Fluorescein ist ausgeprägt pH-empfindlich und verliert unterhalb von etwa pH 7 an Intensität, bleicht schnell aus und ist ab dem Öffnen des Vials lichtempfindlich — Braunglas-Vials, Alufolie und reduzierte Beleuchtung sind Standard. Molekulargewicht und Reinheit eines markierten Peptids verschieben sich gegenüber der unmarkierten Sequenz, lesen Sie daher das COA des Konjugats und nicht das des Ausgangspeptids.

Verwandte Begriffe und Materialien

Biotin-Markierung · I-125-Radiomarkierung · HPLC. Referenzmaterial: markierte Peptide. Weiterführende Lektüre: Leitfaden zu markierten Peptiden.