Glosar
Marcaj cu biotină
Biotinilarea oferă unei peptide o ancoră cu afinitate femtomolară pentru captura cu streptavidină. Lungimea distanțierului, biotina endogenă și eluția.
Un marcaj cu biotină este o moleculă de biotină (vitamina B7) conjugată la o peptidă, în mod normal la capătul N-terminal sau pe catena laterală a unei lizine. Valoarea sa constă în interacțiunea cu streptavidina: o constantă de disociere în domeniul femtomolar, una dintre cele mai puternice legături necovalente din biologie, stabilă la detergenți, concentrații mari de sare și denaturanți moderați.
Cum se utilizează și ce limitări are
Peptidele biotinilate sunt instrumentul standard pentru experimentele de tip pull-down și identificarea țintelor pe bile magnetice cu streptavidină, pentru imobilizarea pe plăci ELISA și cipuri SPR acoperite cu streptavidină și pentru detecția amplificată, în care un conjugat streptavidină-HRP înlocuiește un anticorp secundar marcat.
Trei limitări practice revin constant. Prima este lungimea distanțierului: coada de acid valeric a biotinei este scurtă, iar buzunarul de legare este adânc, astfel încât se introduce în mod normal un linker de acid aminohexanoic sau PEG pentru a menține peptida accesibilă. A doua este biotina endogenă: țesuturi precum ficatul, rinichiul și creierul conțin suficientă biotină liberă pentru a concura, fiind necesară o etapă de blocare avidină/biotină. A treia este eluția: interacțiunea este atât de puternică încât recuperarea complexelor intacte necesită în general fierbere în SDS, exces de biotină liberă cu incubare îndelungată sau un linker scindabil, prevăzut încă de la început.
Termeni și materiale înrudite
marcaj FAM/FITC · radiomarcaj I-125 · puritate. Material de referință: peptide marcate, anticorpi marcați. Lectură suplimentară: ghidul peptidelor marcate.