Ghiduri pe molecule
Anticorpi policlonali și antiseruri: ce sunt și cum se aleg
Cum alegeți un anticorp anti-peptidă: antiser vs IgG purificat vs purificat prin afinitate, imunogen și epitop, reactivitate de specie, controale, depozitare.
Anticorpii policlonali și antiserurile sunt reactivii de detecție ai cercetării peptidelor: obținuți într-un animal-gazdă împotriva unui imunogen peptidic definit, aceștia recunosc ținta în secțiuni tisulare, pe bloturi și în imunoteste. Secțiunea de anticorpi a catalogului este dominată de anticorpi policlonali, nu de monoclonali, dintr-un motiv precis — peptidele scurte au puțini epitopi, iar un răspuns policlonal care acoperă mai mulți dintre aceștia detectează ținta mai robust decât o singură clonă monoclonală îndreptată împotriva unei molecule care poate avea doar zece resturi.
Antiser, IgG purificat sau purificat prin afinitate: ce cumpărați de fapt
Intrările din glosar pentru antiser, IgG purificat și anticorpi policlonali versus monoclonali prezintă distincțiile mai în detaliu. Înregistrările din catalog precizează formatul fiecărui articol; simplul termen „anticorp” nu constituie o specificație suficientă.
Imunogenul este specificația
Tot comportamentul unui anticorp anti-peptidă decurge din ceea ce a fost folosit pentru imunizare. Secvența imunogenului vă arată ce regiune a moleculei-mamă este recunoscută, iar aceasta determină trei lucruri pe care trebuie să le știți înainte de comandă. Distinge anticorpul formele procesate? Un anticorp obținut împotriva capătului C-terminal al unei peptide nu va recunoaște un precursor extins la capătul C-terminal — exact ce vă doriți dacă măsurați hormonul matur și exact ce nu vă doriți dacă măsurați forma totală. Reacționează încrucișat în cadrul familiei? Antiserurile îndreptate împotriva regiunii mediane conservate a produselor proglucagonului recunosc deopotrivă glucagonul, glicentina și oxintomodulina. Este necesară o modificare? Anticorpii fosfo-specifici și cei specifici amidării sunt obținuți împotriva unor imunogeni modificați și nu ar trebui să recunoască secvența nemodificată — această specificitate reprezintă întreaga valoare a reactivului în studiile privind tau și neuropeptidele.
Specia-gazdă, reactivitatea de specie și cele două moduri în care contează
Acestea sunt specificații diferite și ambele contează. Specia-gazdă — de obicei iepurele, uneori capra, oaia sau cobaiul — determină ce anticorp secundar vă trebuie și ce anticorpi primari pot fi combinați în multiplex. Doi anticorpi primari de iepure nu pot fi distinși prin anticorpul secundar în aceeași secțiune. Reactivitatea de specie indică varianta țintei din ce organisme este recunoscută de anticorp și decurge din conservarea secvenței, nu din gazdă. Un anticorp de iepure obținut împotriva beta-amiloidului uman poate recunoaște sau nu secvența de rozătoare; înregistrarea din catalog precizează reactivitatea testată, iar speciile netestate trebuie tratate ca necunoscute, nu presupuse. Consultați reactivitatea de specie.
Validare: controalele care fac un rezultat publicabil
Specificitatea anticorpilor este cea mai frecventă problemă de reproductibilitate în cercetarea peptidelor, iar controalele sunt bine stabilite. Controlul cu peptidă de blocare este cel principal: preincubați anticorpul cu un exces de peptidă imunogenă, iar colorația sau benzile specifice ar trebui să dispară, în timp ce semnalul nespecific persistă. Pentru majoritatea antiserurilor din catalog este disponibilă o peptidă de blocare corespunzătoare, iar utilizarea ei face diferența dintre o imagine sugestivă și una argumentată. În plus: o probă knockout sau knockdown, acolo unde există, un control doar cu anticorp secundar și — pentru afirmații cantitative — o confirmare ortogonală prin spectrometrie de masă sau un anticorp independent împotriva unui alt epitop. Domeniile în care validarea anticorpilor a fost contestată public, precum irisina, sunt exact cele în care aceste controale sunt obligatorii.
Specificațiile de aplicare și ce înseamnă
Înregistrările din catalog listează aplicațiile validate cu diluțiile de lucru sugerate — de regulă imunohistochimie, imunofluorescență, Western blot, ELISA, RIA și imunoprecipitare. Se aplică două precauții. În primul rând, un anticorp validat pentru o aplicație poate eșua în alta: reactivii care recunosc epitopi conformaționali funcționează adesea în imunohistochimie și eșuează într-un Western denaturant, în timp ce anticorpii pentru epitopi liniari prezintă adesea tiparul opus. În al doilea rând, diluțiile de lucru sunt puncte de pornire care trebuie titrate în propriul sistem, nu valori fixe — tipul probei, fixarea și chimia de detecție modifică toate optimul. Lucrările de imunoprecipitare asociază în general anticorpul cu bile magnetice, iar anticorpii marcați poartă conjugații folosiți pentru detecția directă.
Depozitare și manipulare
Anticorpii sunt proteine în soluție și se manipulează destul de diferit față de peptidele liofilizate. Alicotați la primire — acest lucru contează mai mult pentru anticorpi decât pentru aproape orice altceva din catalog, deoarece ciclurile repetate de congelare-decongelare agregă IgG și reduc ireversibil titrul. Păstrați alicotele de unică folosință la −20 °C sau la 2–8 °C pentru o alicotă de lucru în uz pe termen scurt și țineți cont de conservantul menționat pe flacon: azida de sodiu este frecventă și este incompatibilă cu detecția cu peroxidază de hrean, așa că anticorpii care conțin azidă trebuie dializați înainte de conjugarea cu HRP. Antiserurile liofilizate trebuie reconstituite în volumul de apă indicat și apoi alicotate imediat. Evitați congelatoarele fără dezghețare (frost-free), ale căror cicluri de dezghețare supun stocul unor decongelări parțiale repetate. Principiile generale se găsesc în ghidul de alicotare și în ghidul de depozitare.
Locul anticorpilor față de celelalte tipuri de produse
Comandați un anticorp atunci când trebuie să detectați sau să localizați molecula endogenă în țesut, celule sau lizat. Comandați standardul peptidic corespunzător drept control cu peptidă de blocare și drept control pozitiv pe blot. Comandați un kit ELISA sau RIA atunci când întrebarea este cât de multă țintă se află într-o probă — kitul reunește o pereche de anticorpi potriviți, standarde și un interval validat și este mai rapid și mai reproductibil decât asamblarea componentelor. Porniți de la hub-ul catalogului sau de la o temă precum Alzheimer, cancer sau diabet, unde alegerea anticorpului poartă cea mai mare parte a greutății experimentale. Toate articolele din catalog sunt furnizate exclusiv pentru cercetare in vitro și pe animale, în cadrul protocoalelor aprobate, și niciunul nu este un reactiv de diagnostic.
Întrebări
De ce sunt anticorpii anti-peptidă de obicei policlonali și nu monoclonali?
Pentru că peptidele scurte prezintă puțini epitopi. Un răspuns policlonal acoperă mai mulți dintre aceștia, oferind o detecție mai robustă atunci când un singur epitop este mascat prin fixare, denaturare sau de un partener de legare. Anticorpii monoclonali oferă consecvență de la lot la lot și precizie la nivelul unui singur epitop, ceea ce contează în studiile fosfo-specifice, dar pentru majoritatea peptidelor mici un policlonal bine purificat detectează mai fiabil.
Ar trebui să cumpăr antiser integral sau anticorp purificat prin afinitate?
Antiser pentru RIA și EIA, unde fondul este tolerabil și costul per test contează. Purificat prin afinitate pentru imunohistochimie, imunofluorescență și Western blot pentru ținte slab exprimate, unde imunoglobulinele serice nespecifice produc un fond pe care nicio blocare nu îl elimină. IgG purificat cu proteină A/G se situează între cele două și este util mai ales atunci când este necesară o concentrație definită de IgG.
Cum confirm că un anticorp este specific?
Efectuați controlul cu peptidă de blocare: preincubați cu un exces de peptidă imunogenă și confirmați că semnalul specific dispare, în timp ce fondul persistă. Adăugați un control doar cu anticorp secundar și o probă knockout sau knockdown, dacă este disponibilă. Pentru afirmații cantitative, confirmați cu un al doilea anticorp împotriva unui alt epitop sau prin spectrometrie de masă. Menționați controalele în secțiunea de metode.
Pot folosi același anticorp atât pentru imunohistochimie, cât și pentru Western blot?
Doar dacă ambele aplicații sunt validate. Anticorpii care recunosc epitopi conformaționali funcționează adesea pe țesut fixat și eșuează după denaturarea cu SDS; anticorpii pentru epitopi liniari prezintă frecvent situația inversă. Înregistrarea din catalog listează aplicațiile testate — o aplicație nelistată este netestată, nu doar nerecomandată, și trebuie validată mai întâi în propriul sistem.
De ce își pierde anticorpul activitatea în timp?
Aproape întotdeauna din cauza ciclurilor de congelare-decongelare. Fiecare ciclu agregă o fracțiune din IgG, iar pierderea este cumulativă și ireversibilă. Alicotați în volume de unică folosință la primire și nu recongelați niciodată o alicotă de lucru. Congelatoarele fără dezghețare (frost-free) agravează problema prin ciclurile lor de dezghețare. Depozitarea la 2–8 °C, cu conservantul indicat, este adecvată pentru o alicotă aflată în uz activ.
Ce influențează azida de sodiu din flacon?
Conservă anticorpul, dar inhibă peroxidaza de hrean, astfel încât un anticorp care conține azidă nu poate fi conjugat cu HRP sau folosit în unele formate de detecție directă fără dializă prealabilă. Este, de asemenea, toxică și necesită o eliminare adecvată. Pentru lucrările de conjugare există formate fără azidă — verificați compoziția tamponului în înregistrarea din catalog.