Molecuulgidsen
Polyklonale antilichamen en antisera: wat ze zijn en hoe u kiest
Hoe u een peptideantilichaam kiest: antiserum versus gezuiverd IgG versus affiniteitsgezuiverd, immunogeen en epitoop, speciesreactiviteit, blokkeercontroles, opslag.
Polyklonale antilichamen en antisera zijn de detectiereagentia van het peptideonderzoek: opgewekt in een gastheerdier tegen een gedefinieerd peptide-immunogeen, herkennen ze het doelwit in weefselcoupes, op blots en in immunoassays. De sectie antilichamen van de catalogus wordt om een specifieke reden gedomineerd door polyklonale in plaats van monoklonale antilichamen — korte peptiden dragen weinig epitopen, en een polyklonale respons die er meerdere afdekt, detecteert het doelwit robuuster dan één monoklonale kloon tegen een molecuul dat mogelijk slechts tien residuen lang is.
Antiserum, gezuiverd IgG of affiniteitsgezuiverd: wat u werkelijk koopt
De woordenlijstitems over antiserum, gezuiverd IgG en polyklonaal versus monoklonaal zetten de verschillen uitgebreider uiteen. Catalogusitems vermelden welk formaat elk artikel heeft; "antilichaam" alleen is geen toereikende specificatie.
Het immunogeen is de specificatie
Alles aan het gedrag van een peptideantilichaam volgt uit datgene waartegen het is opgewekt. De immunogeensequentie vertelt u welk gebied van het oudermolecuul wordt herkend, en dat bepaalt drie dingen die u vóór het bestellen moet weten. Onderscheidt het bewerkte vormen? Een antilichaam dat is opgewekt tegen de C-terminus van een peptide herkent geen C-terminaal verlengde precursor — precies wat u wilt als u het rijpe hormoon meet, en precies verkeerd als u het totaal meet. Kruisreageert het binnen de familie? Antisera tegen het geconserveerde middengebied van proglucagonproducten herkennen glucagon, glicentine en oxyntomoduline in gelijke mate. Is een modificatie vereist? Fosfospecifieke en amideringsspecifieke antilichamen worden opgewekt tegen gemodificeerde immunogenen en horen de niet-gemodificeerde sequentie niet te herkennen — die specificiteit is de volledige waarde van het reagens in tau- en neuropeptideonderzoek.
Gastheerspecies, speciesreactiviteit en de twee manieren waarop ze ertoe doen
Dit zijn verschillende specificaties en beide doen ertoe. De gastheerspecies — meestal konijn, soms geit, schaap of cavia — bepaalt welk secundair antilichaam u nodig hebt en welke primaire antilichamen samen in multiplex kunnen worden gebruikt. Twee primaire konijnenantilichamen zijn in dezelfde coupe niet met een secundair antilichaam van elkaar te onderscheiden. De speciesreactiviteit geeft aan van welke organismen de versie van het doelwit door het antilichaam wordt herkend; ze volgt uit sequentieconservering, niet uit de gastheer. Een konijnenantilichaam dat is opgewekt tegen humaan amyloïd-bèta herkent de knaagdiersequentie wel of niet; het catalogusitem vermeldt de geteste reactiviteit, en niet-geteste species moeten als onbekend worden behandeld in plaats van als aangenomen. Zie speciesreactiviteit.
Validatie: de controles die een resultaat publiceerbaar maken
Antilichaamspecificiteit is het meest voorkomende reproduceerbaarheidsprobleem in peptideonderzoek, en de controles zijn goed ingeburgerd. De controle met blokkerend peptide is de voornaamste: pre-incubeer het antilichaam met een overmaat immunogeenpeptide, waarna specifieke kleuring of bandvorming moet verdwijnen terwijl niet-specifiek signaal blijft. Voor de meeste antisera in de catalogus is een bijpassend blokkerend peptide verkrijgbaar, en het gebruik ervan maakt het verschil tussen een suggestief beeld en een onderbouwd beeld. Daarnaast: een knock-out- of knockdownmonster waar dat bestaat, een controle met alleen secundair antilichaam en — voor kwantitatieve claims — orthogonale bevestiging met massaspectrometrie of een onafhankelijk antilichaam tegen een ander epitoop. Vakgebieden waarin antilichaamvalidatie publiekelijk is betwist, zoals irisine, zijn precies de plaatsen waar deze controles niet onderhandelbaar zijn.
Toepassingsspecificaties en wat ze betekenen
Catalogusitems vermelden gevalideerde toepassingen met aanbevolen werkverdunningen — doorgaans immunohistochemie, immunofluorescentie, Western blot, ELISA, RIA en immunoprecipitatie. Er gelden twee kanttekeningen. Ten eerste kan een antilichaam dat voor de ene toepassing is gevalideerd, bij een andere falen: reagentia die conformationele epitopen herkennen, werken vaak in immunohistochemie en falen op een denaturerende Western, terwijl antilichamen tegen lineaire epitopen vaak het omgekeerde patroon laten zien. Ten tweede zijn werkverdunningen uitgangspunten die u in uw eigen systeem moet titreren, geen vaste waarden — monstertype, fixatie en detectiechemie verschuiven allemaal het optimum. Bij immunoprecipitatie wordt het antilichaam doorgaans gecombineerd met magnetische beads, en gelabelde antilichamen dragen de conjugaten die voor directe detectie worden gebruikt.
Opslag en hantering
Antilichamen zijn eiwitten in oplossing en worden heel anders gehanteerd dan gevriesdroogde peptiden. Aliquoteer bij ontvangst — dit is voor antilichamen belangrijker dan voor vrijwel alles in de catalogus, omdat herhaald invriezen en ontdooien IgG doet aggregeren en de titer onomkeerbaar verlaagt. Bewaar aliquots voor eenmalig gebruik bij −20 °C, of bij 2–8 °C voor een werkaliquot dat op korte termijn wordt gebruikt, en houd rekening met het conserveermiddel dat op de flacon staat vermeld: natriumazide komt veel voor en is onverenigbaar met detectie via mierikswortelperoxidase, dus azidehoudende antilichamen moeten vóór HRP-conjugatie worden gedialyseerd. Gevriesdroogde antisera moeten worden gereconstitueerd in het aangegeven volume water en daarna direct worden gealiquoteerd. Vermijd no-frostvriezers, waarvan de ontdooicycli de voorraad herhaaldelijk gedeeltelijk laten ontdooien. De algemene principes staan in de gids over aliquoteren en de gids over opslag.
Waar antilichamen passen ten opzichte van de andere producttypen
Bestel een antilichaam wanneer u het endogene molecuul in weefsel, cellen of een lysaat moet detecteren of lokaliseren. Bestel de bijpassende peptidestandaard als controle met blokkerend peptide en als positieve controle op een blot. Bestel een ELISA- of RIA-kit wanneer de vraag is hoeveel doelwit er in een monster aanwezig is — de kit bundelt een op elkaar afgestemd antilichaampaar, standaarden en een gevalideerd bereik, en is sneller en beter reproduceerbaar dan het zelf samenstellen van de onderdelen. Begin bij de catalogushub, of bij een thema zoals Alzheimer, kanker of diabetes, waar de keuze van het antilichaam het grootste deel van het experimentele gewicht draagt. Alle catalogusartikelen worden uitsluitend geleverd voor in-vitro- en goedgekeurd dieronderzoek, en geen ervan is een diagnostisch reagens.
Vragen
Waarom zijn peptideantilichamen meestal polyklonaal en niet monoklonaal?
Omdat korte peptiden weinig epitopen presenteren. Een polyklonale respons dekt er meerdere af, wat robuustere detectie geeft wanneer één epitoop door fixatie, denaturatie of een bindingspartner wordt gemaskeerd. Monoklonale antilichamen bieden consistentie van lot tot lot en precisie op één epitoop, wat van belang is voor fosfospecifiek werk, maar voor de meeste kleine peptiden detecteert een goed gezuiverd polyklonaal antilichaam betrouwbaarder.
Moet ik volledig antiserum of affiniteitsgezuiverd antilichaam kopen?
Antiserum voor RIA en EIA, waar achtergrond aanvaardbaar is en de kosten per assay tellen. Affiniteitsgezuiverd voor immunohistochemie, immunofluorescentie en Western blots van laag-abundante doelwitten, waar niet-specifiek serumimmunoglobuline achtergrond geeft die met geen enkele blokkering te verwijderen is. Met proteïne A/G gezuiverd IgG zit daartussenin en is vooral nuttig wanneer een gedefinieerde IgG-concentratie nodig is.
Hoe bevestig ik dat een antilichaam specifiek is?
Voer de controle met blokkerend peptide uit: pre-incubeer met een overmaat immunogeenpeptide en bevestig dat het specifieke signaal verdwijnt terwijl de achtergrond blijft. Voeg een controle met alleen secundair antilichaam toe, en een knock-out- of knockdownmonster waar beschikbaar. Bevestig kwantitatieve claims met een tweede antilichaam tegen een ander epitoop of met massaspectrometrie. Vermeld de controles in uw methodesectie.
Kan ik één antilichaam gebruiken voor zowel immunohistochemie als Western blot?
Alleen als beide zijn gevalideerd. Antilichamen die conformationele epitopen herkennen, werken vaak op gefixeerd weefsel en falen na SDS-denaturatie; antilichamen tegen lineaire epitopen laten vaak het omgekeerde zien. Het catalogusitem vermeldt de geteste toepassingen — een niet-vermelde toepassing is niet getest, niet slechts niet aanbevolen, en moet eerst in uw eigen systeem worden gevalideerd.
Waarom verliest mijn antilichaam na verloop van tijd activiteit?
Vrijwel altijd door invriezen en ontdooien. Elke cyclus doet een fractie van het IgG aggregeren, en het verlies is cumulatief en onomkeerbaar. Aliquoteer bij ontvangst in volumes voor eenmalig gebruik en vries een werkaliquot nooit opnieuw in. No-frostvriezers maken dit erger door hun ontdooicycli. Opslag bij 2–8 °C met het vermelde conserveermiddel is geschikt voor een aliquot dat actief in gebruik is.
Waarop heeft het natriumazide in de flacon invloed?
Het conserveert het antilichaam, maar remt mierikswortelperoxidase, zodat een azidehoudend antilichaam zonder voorafgaande dialyse niet aan HRP kan worden geconjugeerd of in sommige formaten voor directe detectie kan worden gebruikt. Het is bovendien toxisch en vereist passende afvoer. Voor conjugatiewerk bestaan azidevrije formaten — controleer de buffersamenstelling in het catalogusitem.