Polyklonální protilátky a antiséra: co to je a jak vybírat

Polyklonální protilátky a antiséra jsou detekčními reagenciemi peptidového výzkumu: připravují se v hostitelském zvířeti proti definovanému peptidovému imunogenu a rozpoznávají cíl v tkáňových řezech, na blotech a v imunoanalytických testech. V sekci protilátek v katalogu převažují polyklonální protilátky nad monoklonálními z konkrétního důvodu – krátké peptidy nesou málo epitopů a polyklonální odpověď pokrývající několik z nich detekuje cíl spolehlivěji než jediný monoklonální klon proti molekule, která může mít jen deset reziduí.

Antisérum, purifikovaný IgG, nebo afinitně purifikovaná protilátka: co skutečně kupujete

Hesla glosáře k antisérům, purifikovanému IgG a k polyklonálním versus monoklonálním protilátkám popisují rozdíly podrobněji. Katalogové záznamy uvádějí, o jaký formát se u každé položky jedná; samotné slovo „protilátka“ není dostatečnou specifikací.

Imunogen je specifikace

Veškeré chování protilátky proti peptidu vyplývá z toho, proti čemu byla připravena. Sekvence imunogenu udává, která oblast výchozí molekuly je rozpoznávána, a to určuje tři věci, které potřebujete vědět před objednáním. Rozlišuje zpracované formy? Protilátka připravená proti C-konci peptidu nerozpozná prekurzor prodloužený na C-konci – což je přesně to, co chcete, pokud měříte zralý hormon, a přesně to špatné, pokud měříte celkové množství. Zkříženě reaguje v rámci rodiny? Antiséra proti konzervované střední oblasti produktů proglukagonu rozpoznávají glukagon, glicentin i oxyntomodulin. Je vyžadována modifikace? Fosfo-specifické a amidačně specifické protilátky se připravují proti modifikovaným imunogenům a neměly by rozpoznávat nemodifikovanou sekvenci – tato specifita je celou hodnotou reagencie při práci s tau a neuropeptidy.

Hostitelský druh, druhová reaktivita a dva způsoby, jak na nich záleží

Jde o odlišné specifikace a na obou záleží. Hostitelský druh – obvykle králík, někdy koza, ovce nebo morče – určuje, jakou sekundární protilátku potřebujete a které primární protilátky lze spolu multiplexovat. Dvě králičí primární protilátky nelze ve stejném řezu rozlišit sekundární protilátkou. Druhová reaktivita udává, verzi cíle kterých organismů protilátka rozpoznává, a vyplývá z konzervace sekvence, nikoli z hostitele. Králičí protilátka připravená proti lidskému amyloidu beta může, ale nemusí rozpoznávat sekvenci hlodavců; katalogový záznam uvádí testovanou reaktivitu a netestované druhy je třeba považovat za neznámé, nikoli za předpokládané. Viz druhová reaktivita.

Validace: kontroly, díky nimž je výsledek publikovatelný

Specifita protilátek je nejčastějším problémem reprodukovatelnosti v peptidovém výzkumu a kontroly jsou dobře zavedené. Primární kontrolou je kontrola s blokujícím peptidem: protilátku předinkubujte s nadbytkem imunogenního peptidu a specifické barvení nebo proužky by měly zmizet, zatímco nespecifický signál přetrvá. Pro většinu katalogových antisér je k dispozici odpovídající blokující peptid a jeho použití je rozdílem mezi sugestivním obrázkem a doloženým výsledkem. Dále: vzorek s knockoutem nebo knockdownem, pokud existuje, kontrola pouze se sekundární protilátkou a – u kvantitativních tvrzení – ortogonální potvrzení hmotnostní spektrometrií nebo nezávislou protilátkou proti jinému epitopu. Obory, v nichž byla validace protilátek veřejně zpochybněna, například irisin, jsou právě ty, kde jsou tyto kontroly nezbytné.

Specifikace aplikací a co znamenají

Katalogové záznamy uvádějí validované aplikace s doporučenými pracovními ředěními – typicky imunohistochemii, imunofluorescenci, Western blot, ELISA, RIA a imunoprecipitaci. Platí dvě upozornění. Zaprvé, protilátka validovaná pro jednu aplikaci může v jiné selhat: reagencie rozpoznávající konformační epitopy často fungují v imunohistochemii a selhávají na denaturujícím Western blotu, zatímco protilátky proti lineárním epitopům často vykazují opačný vzorec. Zadruhé, pracovní ředění jsou výchozími body, které je třeba titrovat ve vlastním systému, nikoli pevnými hodnotami – typ vzorku, fixace i detekční chemie posouvají optimum. Imunoprecipitace obvykle kombinuje protilátku s magnetickými kuličkami a značené protilátky nesou konjugáty používané k přímé detekci.

Skladování a manipulace

Protilátky jsou proteiny v roztoku a zachází se s nimi zcela jinak než s lyofilizovanými peptidy. Po doručení je rozdělte na alikvoty – u protilátek na tom záleží více než téměř u čehokoli jiného v katalogu, protože opakované zmrazování a rozmrazování agreguje IgG a nevratně snižuje titr. Jednorázové alikvoty skladujte při −20 °C, případně pracovní alikvot při krátkodobém používání při 2–8 °C, a mějte na paměti konzervační látku uvedenou na lahvičce: azid sodný je běžný a je neslučitelný s detekcí křenovou peroxidázou, proto je nutné protilátky obsahující azid před konjugací s HRP dialyzovat. Lyofilizovaná antiséra je třeba rekonstituovat v uvedeném objemu vody a ihned rozdělit na alikvoty. Vyhněte se mrazničkám s funkcí no-frost, jejichž odmrazovací cykly vystavují zásobu opakovanému částečnému rozmrazení. Obecné zásady uvádí průvodce alikvotací a průvodce skladováním.

Místo protilátek mezi ostatními typy produktů

Protilátku objednejte, když potřebujete detekovat nebo lokalizovat endogenní molekulu ve tkáni, buňkách nebo lyzátu. Odpovídající peptidový standard objednejte jako kontrolu s blokujícím peptidem a jako pozitivní kontrolu na blotu. Kit ELISA nebo RIA objednejte, pokud je otázkou, kolik cíle je ve vzorku přítomno – kit obsahuje sladěný pár protilátek, standardy a validovaný rozsah a je rychlejší a reprodukovatelnější než sestavování jednotlivých částí. Začněte v centru katalogu nebo u tématu jako Alzheimerova choroba, rakovina či diabetes, kde výběr protilátky nese většinu experimentální váhy. Všechny katalogové položky jsou dodávány výhradně pro in vitro a schválený zvířecí výzkum a žádná z nich není diagnostickou reagencií.