HPLC

A HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) faz passar uma amostra dissolvida por uma coluna empacotada sob alta pressão, de modo que os componentes se separam consoante a intensidade da sua interação com a fase estacionária. Para péptidos, o método padrão é a HPLC de fase reversa numa coluna C18 com um gradiente água/acetonitrilo e 0,1% de ácido trifluoroacético, com deteção por absorvância UV a 214 nm, onde a própria ligação peptídica absorve.

O que significa o valor de pureza

A pureza reportada é normalmente em percentagem de área: a área do pico principal dividida pela área total de todos os picos integrados. Um resultado de 98,6% significa que 98,6% do sinal UV detetado eluiu como um único pico. É uma medida relativa, e não uma dosagem de quanto péptido existe no frasco — a água, o contraião e os excipientes que não absorvem são-lhe invisíveis.

O que não lhe diz

A HPLC separa; não identifica. Uma sequência de deleção com eluição muito próxima pode esconder-se sob o pico principal, e uma impureza sem cromóforo pode não ser registada a 214 nm. É por isso que um certificado credível associa o cromatograma a um resultado de identidade por espectrometria de massa para o mesmo lote.

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